196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
20 196456 21 Az eredmények a következő felismerésekre vezetnek: Olyan fúzionátumok, amelyeket lizis-frakciókkal állítottunk elő, HAT-szelekció nélkül tenyészthetők. Az eljárás sokkal kevésbé munkaigényes, mint a citochalasin-B-extrúzió, és magas kitermeléssel szolgáltat fúzióképes anyagot. A .mag-" és .citoplazma-membrán "-frakciókra való tiszta szétválasztás a két eljárás egyikével sem érhető el. Mind a túlnyomórészt mag-anyagot tartalmazó mind a túlnyomórészt citoplazma-membrán-hólyag tartalmú frakció vérből nyert emberi limfocitákkal való fúzió után in vitro szaporodásképes, AT-termelő sejt-klónokat képez. A mag-limfocita-hibridek párhuzamos kísérlete HAT-adalékkal és HAT-adalék nélkül a szelekciós táptalaj negatív behatásait dokumentálja: HAT-tal a primer-tenyészetek 23%-a Ig-negativ és csak 40%-a erősen pozitív; HAT nélkül 70% feletti erősen pozitív és csak 4% lg-negativ. 3. példa. Immunizált egerek lépsejtjeinek fúziója natív és fragmentált Ag 8.653 mielómasejtekkel. Anyagok. Humán pajzsmirigy-stimuláló hormont (hTSH) és ennek izolált /j-láncát (ß-hTSH) a Boehringer Mannheim cégtől szereztük be. Komplett és inkomplett Freud-féle adjuvánst (CFA, IFA) a Difco-tól, Methocel 1500-at a FLUKA cégtől és FITC-golyókat a Covalent Tech. Co., Ann. Arbor, Michigan, USA cégtől szereztünk be. Módszerek. Immunizálás: Balb/c-egereket phTSH-val (10 jug CFA-ban, intraperitonealisan) primer immunizálunk (1. napi), és a 196. napon hTSH-val (50 pg IFA-ban, intraperitonealisan), a 266. napon hTSH-val segédanyag nélkül intraperitonealisan, valamint a 294. napon hTSH-val intravénásán .emlékeztetünk". . Az immunizált egerek egyikétől 3 nappal az utolsó emlékeztető immunizálás után az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint körülbelül 1 x 108 lépsejtet nyerünk, és felét-felét két fúzióhoz használjuk fel. 1. fúzió: 5 x 107 lépsejtet és 1 x 107 Ag 8,653-sejtet összekeverünk az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint, fúzionáljuk, és 4824-es csepptenyészeL-tálcán egér-makrofág-sejtekkel HAT-tartalmú DMEM teljes táptalajban tenyésztjük. 2. fúzió: 1 x 107 Ag 8.653-sejtet a 2. példában leírtak szerint glicerinnel és 10 mmólos trisz-hidroklorid pufferral való fokozatos kezeléssel lizisnek vetünk alá. A citoplaznia-membrán-hólyag-lCMVl-frakciót 5.000 g-nél 4 °C-on 40 percig ülepítve centrifugáljuk. A mag-frakciót 7 x 107 lépsejttel keverjük, centrifugálással a CMV-üledékre rétegezzük, és az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint PEG segítségével a standard eljárással fúzionáljuk. A fúzionátumot DMEM teljes táptalajban 24 db 24-es Costar-féle makrofágos csepptenyészet-tálcára szétosztjuk, és HAT-adalék nélkül tenyésztjük. Híbridsejtek antigénspecifikus jelzése és klónozás: Golyóforniájú fluoreszceinizotiocianátot (FITC-Covaspheres) a gyártó általános előírása szerint hTSH-val kovalensen beborítunk (TSH-CS), és 5%o -es nátrium-azid oldatban tároljuk. A PARKS, D. R. és mtsai. által a Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 1982-1966 (1979)-ben leírt eljárás szerint a sejteket a beborított Covaspheres-el jelezzük, és egy citofluorográf segítségével nagy, fluoreszcencia-pozitiv sejteket helyezünk egyenként csepptenyészetbe és 96-os Costar-féle lemezekre. A csepptenyészeteket 24 órával előbb DMEM teljes táptalajban lévő egér-makrofágokkal borítjuk be. ELISA-teszt TSH-specifikus antitestekre: Rétegezés, a tenyészet-felülúszó inkubálésa, szubsztrátum-reakció és leolvasás az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint. Anti-egér-Ig-POD helyett TSH-POD-konjugátumot használunk. Pozitív kontrollként egy hTSH-hiperimmunizált egér 10~3 higítású szérumét használjuk; negativ kontrollként olyan klón szolgál, amely nem-rokon antigén ellen (egér-anti-digoxin) képez antitesteket. Eredmények. Mind az 1. fúzióból (intakt Ag 8.653-sejtek) mind a 2. fúzióból (Ag 8.653-lizis fragmensek) kapott tenyészetekben a 14. napon az összes csepptenyészetben nagy limfoid sejtek telepeit észlelhettük. A 14. napi tenyészet-felülúszókkal végrehajtott ELISA-teszt TSH-specifikus antitestek kimutatására a 3. táblázatban összefoglalt értékeket adta: Az összes résztenyészetben kimutattunk anti-TSH-t. 3. táblázat. a) 1 2 3 4 5 6 A 235 236 212 149 119 212 B 109 221 119 104 176 068 C 116 108 135 139 093 135 D 171 128 120 228 137 145 b) 1 2 3 4 5 6 A 271 268 267 286 194 291 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
