196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
22 196456 23 1 2 3 4 5 6 !B 288 278 362 317" 280 305 c 207 292 252 226 292 271 D 295 376 370 338 310 333 Negatív-konti'oll (DMEM teljes táptalaj): 000 Pozitiv-kontroll (anti-TSH-egérszérum): 362 ELISA-teszt anti-TSH kimutatására tenyészet-felülúszókban a fúzió utáni 14. napon. a) 1. fúzió (intakt Ag 8.653); b) 2. fúzió (Ag 8.653-fragmensek). A 15. napon az 1. és 2. fúzió egyes csepptenyészeteiböl az össze nem tapadó sejteket kiöblítjük, és külön részletekben TSH-antigén-specifikusan jelezzük (alap: a hibridomák rendszerint, mint a B-limfociták, az általuk szintetizált antitestmolekula egyrészét a setjmembránban lehorgonyozva .kifelé" irányuló antigén-kötőhelyekkel hordozzák), és a sejtválogató segítségével klónozzuk. 4. példa Humán PBL (perifériális vér limfociták) fúziója intakt és fragmentált Ag 8.653--sejtekkel. Anyagok Inaktivált hepatitis-B-felület-antigént (HBsí; Biotest) szérumproteinektöl immunadszorpcióval tisztítunk. ELISA-teszt humán HBs-antitestek kimutatására: Mikrotiter-lemezeket tisztított HSsi (20 Mg/ml 0,9%-os nátrium-klorid oldat) réteggel fedünk be. A tenyészet-felülúszók inkubálását, a konjugátum és szubsztrát reakcióját és a leolvasást az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint végezzük. Ariti-egér-Ig- POD helyett (juh-)anti-humán-Ig-POD-t használunk. Kivitelezés. Magas anti-HBs-titerü donortól származó HPBL-t izolálunk 200 ml vénás vérből Ficoll-gradiens-centrifugálással. A B-limfociták feldúsítása céljából a T-sejteket juh-eritrocitákkal (standard eljárás szerint) rozettázzuk, és egy második Ficoll-gradiens centrifugálással leválasztjuk. A nem-rozettázott sejtek frakcióját [HPBL(B)] 5 x 107 sejtsürűségnél RPMI 1640 + 10% autológ plazmában (30 perc) 56 °C hóinaktiválás (körülbelül 10 ug HBsi-vel széndioxid-inkubátorban tenyésztjük.) Táptalajcsere minden 12 órában.) 1. fúzió: 1 x 107 előkezelt HPBL(B)-t 1 x x 107 Ag 8.653-mal keverünk, és az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint PEG segítségével fuzionáljuk. A fúzionátumot RPMI 1640 + *■ 10% humán-plazma + HAT-ban 4 db 24-es Costar-féle csepptenyészetben tenyésztjük. 2. fúzió: 1,1 x 10“ Ag 8.653 sejtet glicerin-lízissel fragmentálunk. 1 x 107 Ag 8.653 magot 1 x 107 HPBL(B)-val keverünk, és 1 x x 10B Ag 8.653-sejtből nyert membrán-citoplazma-hólyag üledékre rétegezzük. A PEG-vel végzett fúzió után a fúzionátumot 4 db 24-es Costar-féle csepptenyészetben RPMI 1640 + 10% humán-plazmában (HAT-adalék nélkül) tenyésztjük. Eredmények. Az 1. és 2. fúzió minden csepptenyészetében a 3. napLól nagyon nagy, összetapadó sejtek növekedése indult meg. Az 5. napon az össze nem tapadó sejtek főtömegét óvatosan felszuszpendáljuk, és két új 24-es Costar-féle csepptenyészetre osztjuk szét (például Al, B1 és Cl). A 28. napon az 1. fúzióban: kis telepek A2 és A3-ban, a maradék csepptenyészetekben csak összetapadó sejtek; a 2. fúzióban: többszörös telepek raaszsziv növekedése minden csepptenyészetben C3 kivételével. A 35. naptól a tenyészetfelülúszókkal végzett ELISA-tesztek a hepatitis-B-antigén elleni fajlagossággal rendelkező hunién immunglobulinok kimutatására a 4. táblázatban összefoglalt eredményeket adták: az 1. fúzió (intakt Ag 8.653-sejtek; tenyészet HAT-táptalajban) nem szolgáltatott pozitív tenyészetet; ezzel szemben a 2. fúzió 5-12. tenyészetei (Ag 8.653-fragmensek, tenyészet normál táptalajban) egyértelműen anti-HBs- pozitívak voltak. 4. táblázat. a) 1 2 3 4 A 000 000 000 000 B 000 001 011 000 C 005 000 000 004 b) 1 2 3 4 A 010 000 189 553 B 000 003 198 032 C 000 173 000 107 Kegativ-kontroll (anti-HBsnegativ-humánszérum): 000 Pozitiv-kontroll (anti-HBspozitiv-humánszérum): 185 ELISA-teszt humán-anti-HBs kimutatására a tenyészel-felüiúszókból a fúzió utáni 35. na5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
