196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
10 196*155 11 citidinhez és dezoxiodenozihoz, és izobutil csoportot dezoxiguanozinhoz. Hidroxil-csoportot védő csoportként és az ezekből leszármaztatható csoportok alkalmazhatók a legelőnyösebben. Kondenzációs ágensként erős kondenzációs ágensek ajánlatosak, mint pl. 2, 4, 6 triizoprenil benzilszulfonil tetrazolid (TPSTe). A dezoxiribonukleotidok kondenzációjával nyert oligonukleotidok védőcsoportjait az alábbi módon távolíthatjuk el. Az amino-csoportot védő csoportokat és a 3’-hidroxil-csoportokat védő csoportokat, mint pl. az acil csoportból származó csoportokat vizes ammónia-oldattal, majd az 5’-hidroxil csoportokat védő csoportokat, mint pl. a tritil-csoportból származó csoportokat 80 térfogat%-os ecetsav oldattal lehet eltávolítani. A gének kémiai szintézissel történő előállításénak az az előnye, hogy a peptid hozama növelhető olyan genetikai kód alkalmazásával, amely a peptid termelésére használt gazdaszervezetben bőségesen rendelkezésre áll. A szintetizált gén beiktatásának módszerei egy vektorba, a beiktatott génnel rendelkező vektor beiktatásának módszerei a gazdaszervezetbe a gazdaszervezet transzformálása érdekében, valamint a transzformált gazdaszervezet tenyésztésének módszerei a jelen találmány szerinti új, fiziológiailag aktiv peptidek előállítása érdekében ugyanazok, mint a természetes génekkel végzett módszerek, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. A harmadik módszer a következő lépésekből áll: biotechnikai úton nyert gén - azaz egy jelen találmány szerinti peptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kettősszálú DNS-fragmens - kinyerése; a DNS fragmens beiktatása egy sokszorozódásra képes, kifejeződést közvetítő hordozóba; egysejtű organizmus transzformálása a fenti hordozóba beiktatott DNS-fragmenssel transzformánsok képzése érdekében; a keletkezett transzformánsok elkülönítése a szülő-organizmusoktól a DNS fragmens által kiváltott fenotipusos sajátosságok alapján; a transzformánsok tenyésztése a jelen találmány szerinti fiziológiailag aktív peptidek előállítása érdekében. A peptidek különleges fajtái állíthatók elő a fenti eljárással. Ezzel az eljárással elő lehet állítani olyan (I) általános képletű, jelen találmány szerinti fiziológiailag aktív peptidet, amelyben Xi jelentése izoleucil-valil-leucil-glicil-szeril-leucil-glicil csoport, X2 jelentése tirozin-csoport és X3 jelentése a (II) képlettel jelölt, korábban ismertetett speciális peptid-csoport. Ezzel a módszerrel esetenként olyan (I) általános képletű, jelen találmány szerinti peptideket is elő lehet állítani, ahol Xi és X2 jelentése az előző mondatban ismertetett és X3 jelentése a (II) képletű, korábban ismertetett pepiidéhez közel áll, de belőle néhány aminosav másik aminosavvá alakult át, vagy néhány aminosav ki van törölve belőle, vagy néhány többlet-aminosav hozzá van kapcsolva. A harmadik módszer egyik formáját részletesen ismertetjük az alábbiakban: Humán perifériás vér limfocitákat mitogénnel stimulálva mRNS képződését indukáljuk, majd a limfocitákat denaturáljuk. Ezután az mRNS-t tartalmazó RNS-t centrifugálással elkülönítjük a denaturált limfocitáktól. Az igy nyert mRNS-t tartalmazó RNS-ból az mRNS-t elkülönítjük oligo(dT(cellulóz oszlopot alkalmazva. Az igy nyert mRNS-t templátként használva oligo(dezoxiriboziltimin monofoszfát,) (oligo/dT), dezoxiadenozin trifoszfát (dATP) dezoxicitozin triszfát (dCTP), dezoxiguanozin trifoszfát (dGTP) és dezoxiriboziltimin trifoszfát (dTTP) jelenlétében, mRNS és komplementer DNS (cDNS) kettős szálai képződnek reverz transzkriptáz segítségével. Az így nyert mRNS.cDNS kettős szálból az mRNS-t alkáli kezeléssel vagy melegítéssel eltávolítjuk, így cDNS-t nyerünk. Ezt a cDNS-t templátként használva dATP, dCTP, dGTP és dTTP jelenlétében egy kettős szálú DNS - amely egyik végénél kapcsolódik - képződik reverz transzkriptáz vagy DNS polimeráz I segítségével. Az így nyert DNS terminális kapcsolását Sí nukleáz segítségével lehasítjuk. dATP jelenlétében oligo(dezoxiadenozin monofoszfát)-ot (oligo/dA) adunk a fentemlített DNS 3’-termináliséhoz terminális transzferáz segítségével. Eközben pBR 322 plazmidot (F. Bolivar és munkatársai: Új klónozó hordozók képzése és jellemzése II. Több célra alkalmazható klónozó rendszer (Construction and Characterization of new cloning vehicle II; A multipurpose cloning system); Gene, 1977. november) ExoRI restrikciós enzimmel hasítjuk el és tovább kezeljük A-exonukleázzal. Ezután dTTP jelenlétében oligo(dT)-t kötünk a hasított pBR 322 3’ terminálisára terminális transzferáz segítségével. A korábban bemutatott oligo(dA) .farok '-kai ellátott kettős szálú DNS-t és az oligo(dT) .farok‘-kai ellátott lineáris plazmidot összekötjük és temperáljuk, a temperált plazmidot egy E. coli X 1776 törzsbe iktatjuk be (amely törzs az American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, Egyesült Államok, törzsgyüjteményben ATCC 31244 számon van letétbe helyezve] a törzs transzformálása érdekében. A transzformált törzset valamilyen gyógyszerrezisztencia, mint pl. ampicillin rezisztencia alapján szelektáljuk. Másrészt a fentivel azonos módon mitogénnel indukált mRNS-t készítünk és radioaktiven jelzünk az 5' terminálison, T 4 polinukleotid kiiiúzt és (x-«P)ATP-t használva. A jelzett mRNS-t (-^P-mRNS) mintegy 200-szoros mennyiségű jelzetlen mRNS-hez adjuk. A fenti jelzetlen mRNS-t humán perifériás vér limfocitákból nyerjük ki, amelyek nincsenek mitogénnel stimulálva és ezért nem termelik a jelen találmány szerinti fiziológiailag aktiv peptideket. A fenti mRNS keveréket használ5 10 15 20 25 30 35 40 15 50 55 60 65 7
