196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
12 196-155 13 va nyomjelzőként, a transzformélt törzseket a törzs-hibridizációs módszer segítségével határozzuk meg. Ebben a módszerben a 32P-mRNS speciálisan hidridizál cDNS-sel, amely az mRNS templátja segítségével képződik; ez a templát viszont csak olyan mitogén-indukált sejtekben van jelen, amely képes a jelen találmány szerinti peptidet termelni, és nincs jelen az indukálatlan sejtben. A 32P-mRNS-sel hibridizált cDNS-sel rendelkező transzformélt törzs könnyen detektálható, mint árnyék egy autoradiogramon. A 32P-mRNS-sel hibridizéit cDNS-sel rendelkező transzformált törzset denaturáljuk és a DNS-t kinyerjük. A cDNS fragmenst tartalmazó plazmid DNS-t a fentebb nyert DNS-töl ultracentrifugálással különitjük el. Az igy nyert plazmid DNS-t Pst I restrikciós enzimmel elhasítjuk, majd BstNI-vel részlegesen emésztjük. Ezután a jól ismert módszer szerint [K. Itakura és munkatársai: Science, 198. kötet, 1056 o. (1976)1 készített oligonukleotidokat, amelyek képlete a következő: AATTCATGTGTATC GTCCTAGGCTCCCTC GGCTGTTATTGTC TGACAATA ACAGCCGAGGGAGCC TAGGACGATACACATG (ahol A, G, C és T jelentése a korábban megadott, és ahol az egyes képletek baloldali vége 5’ hidroxil csoport oldalláncot képvisel és a jobboldali vége 3’ hidroxil csoport oldalláncot (összeforrasztjuk) egymással, amely által ATG kódon indító triplettel és EcoRI-vel és BotNI-vel hasított terminálisokkal rendelkező kettős szálú oligomert rákapcsoljuk T 4 DNS ligéz segítségével egy BstNI és Pst I restrikciós enzimmel hasított cDNS fragmensre. Az így nyert DNS fragmenst a pBR 322- -nek a BstNI-vel és a Pst I-el történt hasítási helyei közé iktatjuk be. Ezután E. coli triptofán operonjának promotorjával, operátorával és riboszóma kötőhelyével rendelkező, és EcoRI-vel hasított terminálokkal rendelkező, 300 bázispárból álló DNS fragmenst kapcsolunk rá arra a cDNS fragmensre, amely a pBR 322-be van beiktatva az EcoRI hasítási helynél. Ezután az így készített plazmidot E. coli- ba vezetjük be. A fentemlített módszer szerint, amikor a cDNS fragmens megfelelően kötött a promotorhoz az átírás (transzkripció) irányában az E. coli egy sejtjében, a cDNS kezd átiródni mRNS-sé egy operon promotorjának működése segítségével. A továbbiakban az átirt mRNS kezd átíródni aminosavvá a kezdő triplet kodonnál, az előállítani kívánt peptidet adva. Ilyen módszerrel 1 mg előállítani kívánt peptidet lehet kivonni az E. coli tenyésztett sejtjeinek 1 liternyi tápközegéböl. Az E. coli sejteket, amelyek az előállítani kívánt peptidet termelik, az inkubáció után összegyűjtjük . és bakteriolizisnek vetjük alá. A lizált sejteket tartalmazó oldatban a nukleinsavakat ribonukleázzal és dezoxiribonukleázzal emésztjük el, majd az előállítani kívánt peptidet kisózással kicsapjuk, 65%-os ammóniumszulfátos telítéssel. A kicsapott frakciót tisztítjuk, ellenőrzött pórusméretű üvegágyat alkalmazva. A jelen találmány szerinti új, fiziológiailag aktiv peptidek aminosav szekvenciájának meghatározási módszere a következő. Először a jelen találmány szerinti új, fiziológiailag aktív peptid metionil-kötéseit brómciánnal hasítjuk. Az elhasitott fragmenseket Sephadex G-100 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Svédország) oszlopon különítjük el, és az egyes fragmensek aminosav szekvenciáját az N-terminálistól kezdve az ismert nagy pontosságú aminosav szekvencia analízissel határozzuk meg. Másrészt a jelen találmány szerinti új, fiziológiailag aktív peptidet részlegesen emésztjük tripszinnel és azután az igy nyert fragmenseket Sephadex G-100 oszlopon különitjük el. Ugyanolyan módszerrel, ahogyan fentebb leírtuk, az egyes fragmensek aminosav szekvenciáját az N-terminálistól kezdve az ismert nagy pontosságú aminosav szekvencia analízissel határozzuk meg. A brómciános hasítással nyert fragmensek aminosav szekvenciáját összehasonlítva a tripszines emésztéssel nyert fragmensek aminosav szekvenciájával, a fragmensek elrendezése a pepiidben meghatározható. így a jelen találmány szerinti új, fiziológiailag aktiv peptidek aminosav szekvenciáját meghatározzuk. A sejtburjánzás gátlásához, azaz a rosszindulatú tumorsejtek burjánzásának gátlásához a jelen találmány szerinti peptidet általában beadhatjuk intravénás, intramuszkuláris vagy bőr alatti injekció formájában. A jelen találmány szerinti peptidek napi adagja természetesen változik a páciens korától, kondíciójától és testsúlyétól függően. A peptidet általában felnőtteknek 1.104-1.109 egység/nap mennyiségben adjuk be injekció formájában, A vírusok által kiváltott rendellenességek kezeléséhez kenőcsöt alkalmazunk, a kenőcs 10 g-ja Í.IO^I.IO9 egység jelen találmány szerinti peptidet tartalmaz. Hagyományos, ismert, gyógyszerészetileg elfogadható kenőcs-alapok használhatók a jelen találmány szerinti peptidet tartalmazó kenőcsök készítéséhez. A napi adag természetesen változik a páciens korától és kondíciójától függően. A jelen találmány szerinti peptidet tartalmazó kenőcsöt azonban többször is lehet alkalmazni, a jelen találmány szerint peptidet 1.104- -1.109 egységnyi adagokban használva. A jelen találmányt részletesen szemléltetik az alább következő példák anélkül azonban, hogy a jelen találmány oltalmi köre kizárólag ezekre korlátozódna. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
