196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
8 196455 9 és a peptidlánc bármiféle káros változást szenvedne. Ilyen előnyös oC-amino csoportot védő csoportként a tercier butoxi-karbonil (Boc) csoport említhető meg elsőként. A Boc csoport könnyen eltávolítható a peptid-léncról 1 n HCl/ecetsav keverékkel, 4 n HCl/dioxán keverékkel vagy 50 súly/térfogat% tetrafluorecetsav (TfaOH)/CH2Cl2 keverékkel. Oldalláncot védő csoporként azok a csoportok előnyösek, amelyek a kötési reakcióban, valamint az oC-amino-csoportot védő csoport eltávolításakor stabilak és a peptid szintézisének utolsó lépésében könnyen eltávolithatók. Ilyen előnyös oldalánc-védő csoportként említhető a nitro- vagy tozil-csoport argininhez; benzil (Bzl) csoport aszparaginsavhoz; benzil- vagy o-metil benzil (OBzl) csoport ciszteinhez és glutaminsavhoz; benzil, benzil-oxi-karbonil (Z) vagy Boc csoport hisztidinhez; Z, tozil vagy diizopropilmetiloxi-karbonil (Dipmoc) csoport lizinhez; szulfoxid-csoport metioninhez és benzil-csoport treoninhez, szerinhez és tirozinhoz. A fentebb említett második eljárást ismertetjük az alábbiakban. Az előállítani kívánt peptidnek megfelelő aminosavak genetikai kódját kiválasztjuk az előállítani kívánt peptid aminosav szekvenciájából. A genetikai kód alapján kémiai úton szintetizáljuk a jelen találmány szerinti fiziológiailag aktív peptidet kódoló szállal rendelkező hibrid kettösszálú DNS-t. A szintetizált DNS fragmenst sokszorozódásra képes kifejeződést közvetítő hordozóba, mint vektorba iktatjuk be. A vektorba iktatott DNS fragmens egysejtű organizmusba iktatáséval az egysejtű organizmus transzformálódik és transzformánsokat képez. A keletkezett transzformánsok szokásos módon különíthetők el a szüló-egysejtű organizmusoktól a DNS fragmens által kiváltott fenotipusos sajátosságok segítségével. Az izolált transzformánsokat tápközegen tenyésztve keletkeznek a peptidek. Ebben a folyamatban azok a peptidek keletkeznek a jelen találmány szerinti (I) általános képletű peptidek közül, amelyekben B jelentése metionin-csoport (MC-peptidek). Amikor az MC peptideket részlegesen hidrolizáljuk aminopeptidázokat alkalmazva, olyan peptideket nyerünk, amelyben a jelen találmány szerinti (I) általános képletű pepiidben B jelentése hidrogén-atom (HC peptidek). Az ebben a folyamatban alkalmazott egysejtű organizmusok vagy gazdasejtek közül megemlithetők a mikroorganizmusok, emlős sejtek, növényi sejtek és hasonlók. Ezek közül a mikroorganizmusok és az emlős sejtek alkalmazhatók előnyösen. Előnyös mikroorganizmusként említhetők olyan élesztők és baktériumok, mint Escherichia coli, Bacillus subtilis, AcLynomyees, Bacillus stearothermophitus. Ebben a folyamatban szaporodásra képes, kifejeződést közvetítő hordozóként vagy vektorként olyanokat használhatunk, amelyekkel a fentemlitett mikroorganizmusok fertőzhetek. Ilyen vektorként említhetők a plazmidok, fágok, virusok és hasonlók. A fentemlitett vektorokat és gazdaszervezeteket lehet alkalmazni akkor is, ha biológiai úton nyert génekből készítünk peptidet. Az egyes aminosavak itt következő genetikai kódját alkalmazzuk a jelen találmány szerinti peptideket kódoló gének szintéziséhez, a genetikai kódban A jelentése dezoxiadenil-sav-csoport, G jelentése dezoxiguanilsav csoport, C jelentése dezoxicitidil-sav csoport és T jelentése timidil-sav csoport, és amelyben a genetikai kód baloldali vége 5’-hidroxil csoportot és a genetikai kód jobboldali vége 3’ hidroxilcsoportot jelent: TTT vagy TTT: fenilalanin; TTA, TTG, CTT, CTC, CTA vagy CTG: leucín; ATT, ATC vagy ATA: izoleucin; ATG: metionin; GTT, GTC, GTA vagy GTG: valin; TCT, TCC, TCA, TCG, AGT vagy AGG: szerin; CCT, CCC, CCA vagy CCG: prolin; ACT, ACC, ACA vagy ACG: treonin; GCT, GGC, GCA vagy GCG: alanin; TAT vagy TAC: tirozin; CAT vagy CAC: hisztidin; CAA vagy CAG: glutamin; AAT vagy AAC: aszparagin; AAA vagy AAG: lizin; GAT vagy GAC: aszparaginsav; GAA vagy GAG: glutaminsav; TGT vagy TGC: ciszteín; TGG: triptofán; CGT, CGC, CGA, CGG, AGA vagy AGG: arginin; és GGT, GGC, GGA vagy GGG: glicin. Ezen kívül az ATG alkalmazható a peptid-szintézis beindításához és a metioninhoz egyaránt és TAA, TAG és TGA alkalmazhatók a peptid-szintézis beállításához. A génben a fentemlitett négy dezoxiribonukleozid bázist foszfodiészter kötések kapcsolják össze a megfelelő 3’ és 5’ helyzeteik között. Ezért a peptideket kódoló gén védőcsoportok és kapcsolást segítő ágensek alkalmazásával szintetizálhatjuk. Előnyös védőcsoportként meg lehet említeni azokat, amelyek szelektíven védik a dezoxiribonukleotidok meghatározott helyeit és amelyek a reakció során stabilak maradnak, valamint könnyen eltávolíthatók anélkül, hogy a nukleotidok közötti kötések elhasadnának. Az intermediereknek könnyen elválaszthatóknak és tisztithatóknak kell lenniök. Ez okból az alább következő triészter-raódszer előnyös a peptideket kódoló gén szintéziséhez. Először az egyes aminosavaknak megfelelő hármas blokkokat (trimer) és - ha kívánatos - kettős blokkokat szintetizáljuk. A blokkokat ezután kondenzáljuk és olyan oligomereket kapunk, amelyek 12-16 nukleotidból álló láncot tartalmaznak. Előnyös, ha a kondenzációt szilárd fázisú módszerrel hajtjuk végre, amelyhez vázanyagként \ aiamiiyen polimert használunk. Az így nyert öli gomert azután meghosszabbítjuk DNS ligáz alkalmazásával, és így kapjuk meg az előállítani kívánt pepiidet kódoló gént. A fentebb enilitelt, dezoxiribonukleotidok amino csoportot védő védőcsoportjaként benzoil csoportot ajánlatos alkalmazni dezoxi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
