196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
6 196455 7 tofán-csoportot, Arg arginin-csoportot és Met metionin-csoportot jelent. A pro-IFN-’ü, IFN-í és IFN-vszerű peptidek aminosav szekvenciája, amint ezt David V. Goeddel az Interferon Kutatás II. Évenkénti Nemzetközi Kongresszusán ismertette, a (III) általános képletnek felel meg: Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Alá Gly His Ser Asp Val Alá Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys lie Met Gin Ser Gin He Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Alá Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Alá Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin - ahol Cys, Tyr, Gin, Asp, Pro, Val, Lys, Glu, Ala, Asn, Leu, Phe, Gly, His, Ser, Ile, Arg, Met és Thr jelentése a korábban megadott, és J jelentése pro-IFN-í esetén: Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gin Ser Leu Gly (ahol Met, Lys, Tyr, Thr, Ser, Ile, Leu, Ala, Phe, Gin, Cys és Val jelentése a korábban megadott), IFN-'X esetében hidrogén-atom és IFN-s-szerű peptid esetén metionin-csoport. A jelent találmány szerinti fiziológiailag aktiv peptidek a hagyományos, ismert módszerekkel állíthatók elő, ilyenek pl. a kővetkezők:- Nobuo Izomiya: Peptidek szintézise (Syntheses of peptides) Szintetikus Kémia Sorozat (Synthetic Chemistry Series) Maruzen KK kiadása, Japán, 1975;- Fehérjék kísérleti biokémiája és kémiája (Experimental Biochemistry) (Chemistry of Proteins) I-IV. Szerkesztette a Japán Biokémiai társaság, Tokyo Kagaku Dozin kiadása, Japán, 1977. Genentikai műveletek (Genetic Engineering): Fehérjék, nukleinsavak és enzimek (Protein, Nucleic Acid and Enzyme) 26. kötet 4. szám. Kyoritsu Shuppan K. K. kiadása, Japán, 1981.- Fejlődés az interferon-kutatásban (Advances in Interferon Researches): Fehérjék, nukleinsavak és enzimek (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), külön kötet, 25. szám Kyoritsu Shuppan K. K. kiadása, Japán, 1981. Azok a módszerek, amelyekkel a jelen találmány szerinti új, fiziológiailag aktiv peptideket elő lehet állítani, három csoportba oszthatók: (1) eljárások, amelyekben a peptideket kémiai szintézissel készítik, (2) eljárások, amelyekben kémiai szintézissel előállított gént iktatnak be egy gazdaszervezetbe, és a pepiidet a gazdaszervezet állítja elő, (3) eljárások, amelyekben biotechnikai úton nyert gént iktatnak be egy gazdaszervezetbe és a pepiidet a gazdaszervezet állítja elő. A fentemlitett első módszernek egyik kiviteli módját, a szilárd fázisú módszert írjuk le az alábbiakban. Az oC-aminocsoporton védőcsoporttal rendelkező aminosav karboxil-csoportját vázanyagra, pl. divinilbenzol keresztkötésekkel ellátott polisztirol gyantára kötjük. Ezután az oC-amino csoportról a védőcsoportot eltávolítjuk. Az oC-amino csoportot védő csoportok eltávolítását és az cC-amino-csoporton védöcsoporttal rendelkező aminosav bevezetését ismételjük egészen addig, amíg az előállítani kívánt pepiidet nyerjük. Ezután a peptid C-terminális aminosavjának karboxil-csoportja és a gyanta közötti kovalens kötést elhasítjuk. Néhány ágens, amelyet a kovalens kötés hasítására alkalmazunk, párhuzamosan hatással lehet az oC-amino csoportot védő csoport, az oldalláncot védő csoport és a kovalens kötés hasítására. A fent leírt szilárd fázisú módszer előnyösebb, mint az úgynevezett folyadék-fázisú módszer, mivel az előbbiben a peptid előállítása egyszerűbb körülmények között történik, az összes reakció egyetlen edényben végbemegy, és az előállítani kívánt peptid nem csupán rövidebb idő alatt készül el, de nagyobb kitermeléssel is, mivel az igy nyert termék a reakcióhoz alkalmazott oldószerben oldhatatlan, ennek megfelelően a reagens feleslege és a melléktermékek szűréssel eltávolíthatók. Az első eljáráshoz vázanyagként 200-400 mesh méretű, divinilbenzol keresztkötésekkel ellátott sztirol polimert (keresztkötések százaléka: 2%) előnyös használni. A gyanta és az aminosav reakciója előtt funkciós csoportot kell bevinni a gyantába, hogy reaktivitás alakuljon ki a gyantán. Egy funkciós csoport bevitelére a gyantába általában alkalmas egy olyan módszer, amelyben a sztirol-egység aromás gyűrűje reagál klórmetil-metiléterrel, SnCl2-t használva a Friedel-Crafts reakció katalizátoraként, és a sztirolegység aromás gyűrűjén klórmetilát csoport alakul ki. Az első eljárásban alkalmazott oC-amino csoportot védő csoportok küzül az olyan csoportok az előnyösek, amelyek a kötés reakcióban stabilak és könnyen eltávolíthatók anélkül, hogy az oldalláncot védő csoportok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 D
