196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
40 196455 41 11. lépés. A plazraid hasítása 20 pg, a 3. példa 10 lépése szerint nyert cirkuláris kettős szálú DNS-t inkubálunk 37 °C hőmérsékleten két óra hosszat 150 ml, Tris-HCl-re (pH 7,5) 10 mmól/liter, magnézium-kloridra 6 mmól/liter, nátrium-kloridra 50 mmól/liter, 2-merkapto-etanolra 6 mmól/liter, BSA-ra 200 mg/ml koncentrációjú, és 20 egység EcoRI restrikciós enzimet tartalmazó oldatban. Ezután pronázt, EDTA-t és SDS-t adunk a keverékhez olyan mennyiségben, hogy a pronáz-koncentráció 0,5 mg/ml, az EDTA-koncentráció 10 mmól/liter és SDS-koncentráció 0,5 tömeg/térfogat% legyen. Miután az Így nyert keveréket 37 °C hőmérsékleten 30 percig tartottuk, a keveréket 30 pl fenol-kloroform (1 : 1) keverékkel extraháljuk. A nem-vizes fázist 50 pl, Tris-HCl-re (pH 7,5) 20 mmól/liter koncentrációjú oldattal mossuk. A mosófolyadékot és a vizes fázist egyesítjük, majd háromszor extraháljuk dietil-éterrel. A kombinált vizes oldathoz 1/10 térfogat 3 mól/liter koncentrációjú nátrium-acetát oldatot és 2,5 térfogat etanolt adunk, és ismét csapadékot nyerünk. Ezután a keveréket 5 percig -70 °C hőmérsékleten hűtjük, majd centrifugáljuk, így végül 9 pg DNS-t nyerünk. 12. lépés. Hasítás Pst I. restrikciós enzimmel A 3. példa 11. lépésében leírtakkal azonos módszert ismételünk meg azzal a kivétellel, hogy 5 pg EcoRI-vei hasított plazmidot - amelyet a 3. példa 11. lépése szerint nyertünk - alkalmazunk a 20 pg cirkuláris kettős szálú DNS helyett és Pst I. restrikciós enzimet alkalmazunk EcoRI restrikciós enzim helyett; így Pst I-el hasított DNS fragmens keveréket nyerünk. A keveréket elektroforézissel szeparáljuk, 2 súly%-os agaróz-gél lemezen (10 x 20 x 0,7 cm), 5 mmól/liter koncentrációjú Tris-ecetsav pufferban (pH 7,8), igy végül kb. 0,2 pg Pst I-el hasított DNS-t nyerünk. 13. lépés. Részleges hasítás BstNI restrikciós enzimmel 0,2 pg, a 12. lépés szerint nyert Pst I-el hasított DNS-t inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 5 percen ét 150 pl, Tris-HCl-re (pH 7,5) 10 mmól/liter, magnézium-kloridra 6 mmól/liter, nátrium-kloridra 50 mmól/liter, 2-merkapto-etanolra 6 mmól/liter, BSA-ra 200 pg/ml koncentrációjú oldatban, amely oldat két egység BstNI restrikciós enzimet is tartalmaz a DNS részleges hasítása érdekében. Ezután fenol-kloroformos kezelést, etanolos kezelést és elektroforézist alkalmazunk a 3. példa 11. lépésben leírtak alapján, így 10 ng BstNI-vel részlegesen hasított DNS fragmenst nyerünk. Ezután a 2. példa 1-5. lépéseiben leírt módszer szerint készített következő oligodezoxinukleotidokat: AATTCATGTGTATC CTCCTAGGCTCCCTC GGCTGTTATTGTC TGACAATA ACAGCCGAGGGAGCC T AGGACGATACACATG (ahol A, G, C és T jelentése a korábban megadott és ahol az egyes képletek baloldali vége 5’-hidroxil-csoport oldalláncot, jobboldali vége 3’-hidroxil-csoport oldalláncot jelent), és fenti részlegesen hasított DNS fragmenseket egymással összeforrasztjuk és T 4 DSN ligázza) összekapcsoljuk ugyanolyan módon, ahogyan ezt a 2. példa 6. lépésében leírtuk. 14. lépés. A peptidek kifejeződése az E. coli- ban A David V. Goeddel áltál leirt módszerrel összhangban (Nature, 287, 411-416 oldal (1980) a fent nyert DNS-t a pBR 322 kimetszett szakaszaiba iktatjuk, amely szakaszok az EcoRI és Pst I hasitó tevékenysége folytán képződnek; 300 bázispárt és ezen belül az E. coli egy triptofán-promotorját, az E. coli egy triptofán-operátorját és egy riboszóma-kötöhelyet tartalmazó EcoRI-hasított fragmenseket képzünk; és a fragmenseket a fenti, kívánt DNS-t tartalmazó pBR 322-höz csatoljuk. Az így nyert plazmidot E. coli x 1776 törzs. Á traszformált törzs inkubálásával nyert tenyészetből egy pepiidet különítünk el egy monoklonális antitest alkalmazásával, amely fajlagosan kötődik a HC(0) pepiidhez; ezt az antitestet David S. Secher és munkatársai által leírt módszerrel [Nature, 285, 446, (1980)] összhangban, antigénként az 1. példa szerint nyert HC(0) peptidet használva nyerjük. Az igy nyert peptidet aminosav-szekvencia analízisnek vetjük alá. Ennek eredménye azt mutatja, hogy a nyert peptid aminosav-szekvenciája egyezésben van az MC(0) pepiidével. 4. Példa A következő kísérleteket hajtottuk végre a D. V. Goeddel által az Interferon Kutatás II. Évenkénti Nemzetközi Kongresszusán ismertetett módszer szerint. A Hind III - Pvu II fragmenst, amely az SV40 replikációs kezdetet tartalmazza [R. M. Myers és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77, 6491 (1980)], átalakítjuk egy EcoRI restrikciós helyhez kötött fragmenssé. A Hind III helyet átalakítjuk egy EcoRI hellyé szintetikus oligomer hozzáadáséval és a Pvu II helyet átalakítjuk egy EcoRI hellyé kapcsolással, amelyet DNS polimeráz alkalmazáséval (Klenow-fragmens) hajtunk végre. Az SV 40 kezdetet tartalmazó EcoRI fragmenst pML-1 [M. Lusky és munkatársai, Nature, 293, 79, (1981)] Eco-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 22
