196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
42 196455 43 Rl-helyére kapcsoljuk. Azokat a kifejeződést közvetítő vektorokat választjuk ki, amelyek a pML-1 ampicíllin rezisztencia génjétől távoli leolvasásra orientált SV-40 késői promotort tartalmazzák. Az ampicillin rezisztencia génhez legközelebbi EcoRI hely a részleges Eco- RI emésztéstől, amelyet a DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével hajtunk végre, és az azt követő kapcsolással eltűnik [K. Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977)]. A 2. példában nyert plazmid Pst I beiktatott szakaszét átalakítjuk egy EcoRI helyhez kötött fragmenssé a Pst I helyre történő beiktatással. Az EcoRI-vel toldott cDNS beiktatott szakaszt a pMl-SV 40 kifejeződést közvetítő vektor egyetlen EcoRI helyére kapcsoljuk, és PTI-SV 40 plazmidot nyerünk. Ezt a vektort vezetjük be transzfekcióval a COS-7 transzformáit majomsejt-vonalba [Y. Gluzman, Cell, 23, 175, (1981)]. A COS-7 belsőleg kifejezi az SV 40 nagy T antigénjét és kimutatható, hogy a pML-1 és SV 40 kezdet szekvenciákat tartalmazó rekombináns plazmidok szaporodását teszi lehetővé. A transzfekciónak alávetett tenyészet sejtközeget naponta mérjük interferon jelenlétére, a 2. példában bemutatott módszer szerint. A transzfekció után 3-4 napra 100 egység/milliliter hozam nyerhető, jelezve, hogy a COS-7 sejtek interferont választanak ki a tépközegbe. 5. Példa Az R. A. Hitzeman és munkatársai által leirt módszerhez [Nature, 293, 717 (1981)] hasonlóan a következő kísérleteket végezzük el. 10 ug Xho I-el hasított pACF 301-et inkubálunk 0,2 egység Bal 31 nukleázzal (BRL) 15 másodpercig 30 °C hőmérsékleten egy olyan vizes keverékben, amely Tris-HCl-re (pH 8,1) 20 mmól/liter, kalcium-kloridra 12 mmól/liter, magnézium-kloridra 12 mmól/liter, nátrium-kloridra 0,2 mól/liter, EDTA-ra 1 mmól/liter és bovin szérum albuminra (BSA) 0,1 mg/ml koncentrációjú. Az idő előrehaladtával a DNS-nek mintegy 50 bázispérját távolítjuk el. Ennek a DNS-nek egy 1 jug-os aiikvotját inkubáljuk DNS-polimeráz I-el (Klenow-fragmens) és dezoxiribo-nukleozid trifoszfáttal a végek betöltése érdekében, majd T 4 DNS iigázzal és szintetikus EcoRI kapcsolóval (Collaborative Research, Egyesült Államok, gyártmánya) inkubéljuk 12 órán ót 14 °C hőmérsékleten. A DNS-t ezután hasítjuk EcoRI és BamHI restrikciós nukleázokkal, és a különbözőképpen hiányos ADH1 promotor szekvenciákat tartalmazó fragmensek keverékét preparatív elektoforézisnek vetjük alá 1 súly% vizes agaróz gélen. Az elektroeluált fragmensek keverékét a pBR 322 nagy EcoRI-BamlII fragmensével kapcsoljuk össze, és az egyedi kiónokat szelektáljuk E. coli RRI (A TTC 31343) törzs transzformálásával, az ampicillin-rezisztens törzsekre szelektálva. Az egyedi telepekről DNS-t preparálunk egy gyors szűrő-vizsgáló eljárással [H. C. Bimbóim és munkatársai, Nucleic Acid Res., 7, 1513 (1979)]. Az egyes hiányok (deléciók) hosszát úgy becsüljük meg, hogy az egyes plazinidokat EcoRI endonukleázzal hasítjuk, a 3' véget Klenow-polimerázzal és [oC-32P] dATP-vel megjelöljük, ezután a DNS-t Alu I endonukleázzal elhasítjuk, és az így nyert kis fragmensek méretét karbamid-akrilamid gélen meghatározzuk. pFRL 4-et alakítunk ki YR p 7-ből [G. Tschumper és munkatársai, Gene, 10, 157 (1980)] az EcoRI helyek eltávolításával (Klenow DNS polimerázzal a .ragadós" végen, és ezt követő .tompa" végű kapcsolással) és az egyik EcoRI-hely helyettesítésével, az YR p 7 kis Hind III fragmensét használva mindkét EcoRI-helyet nélkülöző plazmid kis Hind III fragmensének helyettesítésére. 20 ug pFRL 4-et emésztünk BamHI-vel és EcoRI-vel, ezután elektroforézisnek vetjük alá 1 súly%-os agaróz gélen. A nagy fragmenst (5000 bázispór) kivágjuk a gélből, elektro-eluáljuk, kétszer fenollal és kloroformmal extraháljuk, mielőtt az etanolos kicsapást elvégeznénk. 3 ug így nyert fragmenst ezután külön összekapcsolunk 1 Mg promotor-tartalmú fragmenssel 12 órán át 15 °C hőmérsékleten 50 pl vizes keverékben, amely 0,5 egység T 4 DNS ligázt tartalmaz, és Tris-HCl-re (pH 7,5) 20 mmól/liter, magnézium-kloridra 10 mmól/liter, ditiotreitolra 10 mmól/liter, és ATP-re 0,5 mmól/liter koncentrációjú. E. coli K-12 294 (ATCC 31446) törzset transzformálunk az ampicillinrezisztenciára kapcsoló-keverékkel, és a plazmidokat a transzformációs keveréktől megtisztítjuk. 50 pg 2. példa szerint nyert plazmidot emésztünk EcoRI-vel, azután elektrcforézisnek vetjük alá 1,2 tömeg%-os vizes agaróz gélen. A peptidet kódoló DNS fragmenst a korábban EcoRI-vel hasított és bakteriális alkálikus foszfatázzal kezelt pFRP plazmidban levő egyetlen EcoRI-helyhez kapcsoljuk. A plazmidot ezután Bgl II restrikciós analízissel elemezzük és élesztő transzformálására használjuk fel. Olyan rekombinánsokat, amelyekben a peptidet kódoló DNS a TRPI génhez szolgáló egyes ADH promotor fragmensek között vagy paralell, vagy antiparalell orientációban van behelyezve, élesztőbe vezetjük be standard transzformációs módszert alkalmazva [A. Hinnen és munkatársai, Proc. Nath Acad. Sei. U.S.A. 75, 1929 (1978)]. Az RH 218(trp IJbefogadó élesztőtörzs (ATCC 44076) G. Miozzari és munkatársai, J. Bact., 134, 48-59 (1981) szferoplasztjait elkülönítetten inkubáljuk a plazmid DNS-el, és a keveréket ezután egy triptofánt nem tartalmazó agarrn helyezzük a Iranszformáns telepele kiválasztása érdekében. Az egyes transztól— murisok tenyészeteit triptofán nélküli tápkozegben szelektív nyomást használva növesztjük, a log-fázis közepén összegy üjtjülc és sejt-kivonat készítésére használjuk szferopo 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 23
