196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
34 196455 35 tát oldatot, 50 pl desztillált vizet és 250 m1 etanolt adunk a keverékhez. A 10 perces - 70 °C hőmérsékleten végrehajtott hűtés után a nyert csapadékot 10 000 xg-vel centrifugáljuk 20 percen át, igy nyerünk 5 jug cDNS-t. 3. lépés. A kettős szálú cDNS készítése 5 ug, a 2. lépés szerint nyert egyszálú cDNS-t feloldunk 100 vízben és 100 °C hőmérsékleten két percig melegítjük. Az így nyert oldathoz 250 ul keveréket adunk, amely keverék hővel denaturált kálium-foszfát pufferre (pH 6,9) 0,1 mól/liter, magnézium-kloridra 10 mraól/liter, DTT-re 10 mmól/liter, dATP-re (Schwarz Inc. gyártmánya) 1 mmól/liter, cGTP-re (Schwarz Inc. gyártmánya) 1 mmól/liter, dCTP-re (Schwarz Inc. gyártmánya) 1 mmól/liter 3H-dTTP-re (New England Nuclear Inc. amerikai cég gyártmánya) 1 mmól/1 és E. coli DNS polimeráz I-re (Boehringer Mannheim GmbH, Német Szövetségi Köztársaság, gyártmánya) 150 egység/milliliter koncentrációjú. Az igy nyert keveréket 15 °C hőmérsékleten 6,5 óra hosszat inkubáljuk. Ezután 0,5 mól/liter koncentrációjú EDTA oldatot és 20 tömeg/térfogat%-os SDS-t adunk a keverékhez olyan mennyiségben, hogy az EDTA koncentráció 10 mmól/liter és az SDS koncentráció 0,1 tömeg/térfogat% legyen. Ezután a keveréket 250 /ul fenollal extraháljuk (.fenol-kezelés'). A fenolos fázist 130 pl TE pufferral (Tris-HCl-re (pH 7,5) 20 mmól/liter, EDTA-ra 1 mmól/liter koncentrációjú) vissza-extraháljuk. Az első és második vizes fázist egyesítjük és 3 ml kapacitású Sephadex G-100 oszlopon frakcionáljuk. A radioaktivitást mutató frakciókat egyesitjük és 3 mól/liter nátrium-acélát oldatot adunk az egyesített frakcióhoz úgy, hogy a nátrium-acetát koncentráció 0,3 mól/liter legyen. Ezután az egyesített frakciókhoz 2,5 térfogat etanolt adunk, igy a DNS-t kicsapjuk. Az igy nyert keveréket centrifugáljuk, és 7 ng DNS-t nyerünk. Az igy nyert DNS-t 130 pl Sí puffer-oldatban (amely nátriuin-kloridra 0,5 mól/liter, nótrium-acetátra (pH 4,5) 50 mmól/liter, és cink szulfátra 10 mmól/liter koncentrációjú) oldjuk, majd 37 °C hőmérsékleten 30 percig tartjuk. Ezután 1,3 /ul Sí nukleáz oldatot (10 egység/ul Si-puffer-oldat) adunk az oldathoz, és 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A keverékhez 0,5 mól/liter koncentrációjú EDTA-oldatot és 20 tömeg/térfogat%-os SDS oldatot adunk olyan mennyiségben, hogy az EDTA koncentrációja 5 mmól/liter és az SDS koncentrációja 0,1 tömeg/térfogat% legyen. Az így nyert keveréket 130 ul fenollal extraháljuk. A fenolos fázist 30 /ul TE-puffer-oldattal mossuk. A mosófolyadékot és a vizes fázist egyesítjük, majd Sephadex G-100 oszlopon frakcionáljuk, 0,1 ml-es frakciókat szedve. A radioaktivitást mutató frakciókat egyesítjük, és igy 4 /ug kettős szálú cDNS-t nyerünk. 4. lépés. dAMP-vel hosszabbított DNS készítése 150 ng, 3. lépés szerint nyert kettős szálú cDNS-t 27 °C hőmérsékleten 8 percig inkubáljuk 8 /ul dATP oldatban - amely oldat dATP-re 1 mmól/liter, nótrium-kakodilátra (pH 7,2) 100 mmól/liter, kalcium-kloridra 2,5 mmól/liter, és bovin szérum albuminra (BSA) 5 ug/ul koncentrációjú, és 3-6 egység/jug DNS koncentrációban terminális dezoxinukleotidil transzferózt (ToLT) is tartalmaz -, majd -70 °C hőmérsékletre hűtjük. 5. lépés. A plazmid hasítása EcoRI-vel; dTMP-vel hosszabbitott pBR 322 készítése. 20 /ug pBR 322 plazmidot és 10 egység EcoRI-t (Bethesda Research Laboratories, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 2 órán át 150 /ul keverékben, amely Tris-HCl-re (pH 7,5) 10 mmól/liter, magnézium-kloridra 6 mmól/liter, nátrium-kloridra 50 mmól/liter, 2-merkapto-etanolra 6 mmól/liter és BSA-ra 200 ul/ul koncentrációjú. A keveréket azonos tél-fogatú dietil-éterrel extraháljuk, majd etanolt adunk hozzá, hogy csapadék képződjék. Ezután a csapadékot feloldjuk 100 pl keverékben, amely glicin-nátrium-sóra (pH 9,5) 0,1 mmól/liter, magnézium-kloridra 5 mmól/liter és BSA-ra 50 /ul//ul koncentrációjú. A keverékhez 17 egység A-exonukleázt adunk, majd inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat. Ezután a keveréket fenolos kezelésnek vetjük alá, majd etanolt adunk hozzá, hogy csapadék keletkezzék. A csapadékot (amely hasitott pBR 322) 300 /ul reakciókeverékhez - amely reakciókeverék nátrium-kakodilátra (pH 7,2) 100 mmól/1, dinátrium-hidrogén-foszfátra 10 mmól/liter, magnézium-kloridra 5 mmól/liter, dTTP-re 1 mmól/liter, BSA-ra 50 ug/ul koncentrációjú és 1 mg DSN-re vonnatkoztatva 3-6 egység TdT-t tartalmaz - adjuk, majd 37 °C hőmérsékleten 20 percig inkubáljuk. Ezután a keveréket fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, majd etanolt adunk hozzá a plazmid visszanyerésére. 6. lépés. A pBR 322 és cDNS összeforrasztása 8 ng dAMP-vel hosszabbitott DNS-terméket és 20 ng EcoRI-vel hasitott és dTMP-vel hosszabbított pBR 322-t összekeverünk 5 ul TNE puffer-oldatban. A keveréket 1-1 óra hosszat inkubáljuk 65 °C, majd 45 °C, majd 37 °C, végül 20 °C hőmérsékleten. Ezután 20 ul, Tris-HCl-re (pH 7,5) 100 mmól/liter, kalcium-kloridra 100 mmól/liter és magnézi5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
