196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
36 196455 37 um-kloridra 100 mmól/liter koncentrációjú keveréket adunk hozzá, majd jégen 20 percig hűtjük. 7. lépés. Az E. coli x 1776 transzformációja E. coli x 1776 törzs (ATCC 31244) telepeiről beoltunk 100 ml, 100 pg/ml diamino-pimelinsavval, 10 ug/ml nalidixin-savval és 10 pg/ml ampicillinnel kiegészített tripton-tápközeget. Az E. coli x 1776 törzset 37 °C hőmérsékleten addig növesztjük, amíg a tenyészet optikai sűrűsége 650 nm-nél mérve eléri a 0,6 értéket, majd a tenyészetet 30 percig jégen hűtjük. A tenyészetet 4000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáljuk, igy a sejteket kicsapjuk. A sejteket 50 ml 10 mmól/liter koncentrációjú nátrium-klorid oldattal mossuk, és centrifugálással még egyszer elkülönítjük. Ezután a sejteket 20 ml 100 mmól/liter koncentrációjú kalcium-klorid oldatban szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót 30 percig jégen hűtjük. A szuszpenziót ismét centrifugáljuk, 4 ml 100 mmól/liter koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban újra szuszpendáljuk, majd egy éjszakán át állni hagyjuk. Az ezután kővetkező kísérleteket az Asahi Kaséi Kogyo K. K.-nak P-3 berendezésében végezzük, a Japán Rekombináns DNS irányelvekkel és a fenti cég új rekombináns DNS-bizottságának irányelveivel összhangban. A 3. példa 6. lépése szerint nyert öszszeforrasztott pBR 322-t (rekombináns DNS molekula) adunk 100 /ul fenti szuszpenzióhoz, amely Ca**-al kezelt E. coli x 1776-ot tartalmaz. Az így nyert keveréket 20 percig jégen hűtjük, majd 10 percig +20 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 0,6 ml tripton-tápközeget adunk a keverékhez. Az így nyert keveréket tripton-tápközeges agarlemezen inokuláljuk, amely agar-lemez úgy készül, hogy 100 pg/ml diamino-pimelinsavval, 10 pg/ml nalidixin-savval és 10 pg/ml ampicillinnel kiegészített tripton-tápközeget teszünk egy agar-lemezhez. Miután a baktériumokat 37 °C hőmérsékleten 48 órán át inkubáltuk, minden egyes telepet leszedünk és egy mikro-lemez egy-egy üregébe oltjuk és ott felszuszpendáljuk; minden egyes üreg 100 /ul tripton-tápközeget tartalmaz. Miután 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk, 100 pl 40 súly/térfogat%-os vizes glicerin-oldatot adunk minden egyes üregbe. Ezután a mikrolemezt -20 °C hőmérsékleten tároljuk, igy nyerjük az E. coli x 1776 500 000 transzformánsa mindegyikének kiónjait. 8. lépés. Az mRNS összetételének vizsgálata 200 pg standard, SEA-val indukált mRNS-t nyerünk ugyanolyan módon, ahogyan 20 ezt a 3. példa 1. lépésében leírtuk. Ugyancsak 200 pg standard, SEA-val nem indukált mRNS-t nyerünk a 3. példa 1. lépése szerint azzal a különbséggel, hogy a SEA-val történő indukálás elmarad. 100 pl, [■x32P]ATP-re 1 mmól/liter, Tris-HCl-re 40 mmól/liter, nátrium-kloridra 30 mmól/liter és magnézium-kloridra 5 mmól/liter koncentrációjú, és 10 egység T 4 polinukleotid-kinázt tartalmazó oldatot adunk 10 pg SEA-val indukált mRNS-hez, majd 37 °C hőmérsékleten inkubálurik 10 percen át. Miután a kinázt fenolos kezeléssel inaktiváltuk, 200 pg SEA-val nem indukált mRNS-t oldunk az igy nyert keverékben. A keverékhez 3 mól/liter koncentrációjú nátrium-acetát oldatot adunk olyan mennyiségben, hogy a végső koncentráció 0,3 mól/liter legyen. Ezután 2,5 térfogat etanolt adunk a keverékhez, igy 200 pg olyan csapadékot nyerünk, amely SEA-val indukált, 32P-vel jelzett mRNS-t és SEA-val nem indukált mRNS-t tartalmaz. Centrifugálás után a csapadékot -20 °C hőmérsékleten tároljuk. 9. lépés. A cDNS kiválasztása A 3. példa 7. lépése szerint nyert E. coli x 1776 transzformánst 10 pg/ml ampicillinnel kiegészített tripton-tápközeges agarlemezre oltjuk és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy telepek képződjenek. Ezután Millipore filter HAWD-ből (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Svédország) kb. 82 mm átmérőjű köralakú szűrőket vágunk ki, és 10 percig autoklávozzuk. Az autoklávozott szűröket egy másik, 10 pg/ml ampicillinnel kiegészített tripton-tápkózeges agarlemezre helyezzük. Minden egyes fentiek szerint nyert telepet a szűrőre oltunk, és 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk, hogy a szűrőn látható telepek képződjenek. A telepeket tartalmazó szűrőt 0,5 n nátrium-hidroxid oldatba merítjük 10 percig. Ezután a szűrőt 0,5 mól/liter koncentrációjú Tris-HCl-be (pH 7,5) merítjük 5 percig. Ezután a szűrőt egy nátrium-kloridra 1,5 mól/liter és Tris-HCl-re(pH 7,5) 0,5 mól/liter koncentrációjú oldatba merítjük 5 percre. Végül az így kapott szűrőt egy nátrium-kloridra 0,3 mól/liter és nátrium-citrátra (pH 7) 0,03 mól/liter koncentrációjú oldatba merítjük (ezt az oldatot nevezzük .2 x SSC' oldalnak (az SSC összetétele: nátrium-kloridra 0,15 mól/liter és nátrium-citrátra (pH 7) 0,015 mól/liter koncentrációjú oldat]} 5 percre. Ezután a szűrőt 70 °C hőmérsékleten 3 óra hosszat melegítjük. Egy szűrölapra számítva 1 ml oldatot öntünk egy Petri-csészébe, az oldat Tris-HCl-re (pH 7,5) 50 mmól/liter és formamidra 50 súly/térfogat% koncentrációjú és 4 x SSC-t tartalmaz (azaz nátrium-kloridra 0,6 mól/liter és nátrium-citrátra (pH 7) 0,06 mól/liter koncentrációjú). Ezután a 3. példa 8. lépese szerint nyert mRNS-keveré-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
