196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
32 196455 33-kloridot, 0,2 g kálium-kloridot, 1,15 g dinétrium-hidrogén-foszfátot és 0,2 g kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó vizes oldatban (ezt az oldatot PBP-oldatnak nevezzük). Az így nyert szuszpenziót élénk keverés mellett 17 liter, Tris-HCl-re (pH 7,5) 20 mmól/liter, EDTA-ra 1 mmól/liter koncentrációjú oldatban (TE-puffer-oldat), amely még 2 súly/térfogatX nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) is tartalmaz, oldathoz adjuk, amelyet 50 literes választótölcsérbe helyezzük. Pronázt (gyártó: Calbiochem, Egyesült Államok) adunk hozzá 200 pg/ml koncentrációban, és szobahőmérsékleten egy óra hosszat keverjük. 1/20 térfogat 2 mól/liter koncentrációjú Tris-HCl (pH 9) oldatot adunk a keverékhez, és az így nyert oldatot 15 liter desztillált fenollal extraháljuk 20 percen át élénk keverés mellett. Ezután 3 liter kloroformot adunk hozzá, és további 10 percig keverjük. A kialakult keveréket egy óra hosszat hagyjuk szétválni, majd a vizes fázist elkülönítjük. 18 liter így nyert vizes fázishoz 60 g SDS-t adunk. Az igy nyert keverékből a nukleinsavat a keverék térfogatára vonatkoztatott 1/10 térfogat 3 mól/liter koncentrációjú nátrium-acetát oldattal (pH 5,5), majd a keverék térfogatára vonatkoztatott 2 térfogat etanollal kicsapjuk. Az igy nyert keveréket állni hagyjuk egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten, és a felülúszót gondosan eltávolítjuk egy szifon segítségével. A maradékot -20 °C hőmérsékleten 15 percen át centrifugáljuk 4000 fordulat/perc sebességgel, ezáltal a nukleinsav-precipitátumot kinyerjük. Az igy nyert precipitátumot 200 ml, Tris-HCl-re (pH 7,5) 50 mmól/liter, nátrium-kloridra 100 mmól/liter és EDTA-ra 5 mmól/liter koncentrációjú, és még 0,5 tömeg/térfogat% SDS-t is tartalmazó oldatba (TNE) helyezzük, és keverjük. 350 ml TNE-t adunk a fenti keverékhez, igy a rostos nukleinsav-precipitátum feloldódik. Az így nyert oldatot 5000 fordulat/perc sebességgel 5 percen át centrifugáljuk, a TNE oldatot félretesszük, és a csapadékot összegyűjtjük. Az igy összegyűjtött csapadékot 0,5 tömeg/térfogatX SDS-t is tartalmazó TNE-oldatban oldjuk. A fentebb nyert két TNE-oldatot összekeverjük, és extrahéljuk háromszor azonos térfogatú fenollal, háromszor fél térfogat dietil-éterrel és háromszor azonos térfogatú - dietil-éterrel. A kinyert DNS mennyiséget spektrofotométeren 260 m/u-nal mért adszorpcióval mérjük, a mennyiség kb 100 mg. 27 g 7. típusú oligo(dT)cellulózt P-L Eiochemicals, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) adunk 500 ml fentiek szerint nyert RNS-tartalmú oldathoz. Az igy nyert keveréket egy óra hosszat keverjük szobahőmérsékleten, ezáltal az oligo(dT) cellulózon adszorbeálódik a mRNS. Az adszorbeált mRNS-t tartalmazó oligo (dT) cellulózt 300 fordulat/perc sebességgel 10 percen át centrifugáljuk, majd az igy elkülönített oligo (dT) cellulózt előbb 50 ml, majd 15 ml TNE-oldattal mossuk. Ezután az mRNS-t eluéljuk ötször 2-2 ml vízzel. Az abszorpciós meghatározás azt mutatja, hogy az mRNS teljes hozama 200 pg. 2. lépés. A cDNS készítése 400 pl reakciókeveréket, - amely Tris-HCl-re (pH 7,5) 40 mmól/liter, nátrium-kloridra 30 mmól/liter, magnézium-kloridra 5 mmól/liter, DTT-re (Calbiochem, Egyesült Államok, gyártmánya) 0,5 mmól/liter, oligo(dT)i2-is-ra (P-L Biochemicals, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) 20 pg/milliliter, dGTP-re (Sigma Chemical Company, Inc. Egyesült Államok, gyártmánya) 5 mmól/liter, dCTP-re (Sigma Chemical Company, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) 5 mmól/liter, dTTP-re (Sigma Chemical Company, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) 5 mmól/liter, 32P-dATP-re (New England Nuclear, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) 5 mmól/liter és mRNS-re 60 pg/milliliter koncentrációjú, és tartalmaz még 280 egység madár eredetű mieloblasztózis vírust (AMV) és 600 egység reverz transzkriptázt (Bethesda Research Laboratories, Inc., Egyesült Államok, gyártmánya) is - inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat. Ezután 0,5 mól/liter koncentrációjú EDTA-oldatot illetve 20 tömeg/térfogat%-os SDS oldatot adunk hozzá olyan mennyiségben, hogy az EDTA koncentrációja 10 mmól/liter és az SDS koncentrációja 0,1 súly/térfogatX legyen a keverékben. Az így nyert keveréket extraháljuk azonos térfogatú frissen desztillált fenollal. A fenolos fázist 200 oldattal [amely Tris-HCl-re (pH 7,5) 200 mmól/liter, EDTA-ra 1 mmól/liter koncentrációjú és SDS-re 0,1 súly/térfogat%-os] mossuk, és a mosófolyadékot, valamint az előző vizes fázist egyesítjük. Az egyesített keveréket azonos térfogatú dietil-éterrel extraháljuk és oszlopkromatográfiának vetjük alá. Az oszlopba 3 ml Sephadex G-100 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Svédország, gyártmánya) és TNE együtt van betöltve (ezt a továbbiakban Sephadex G-100 oszlopnak nevezzük). Az oszlopról 0,1 ml-es frakciókat gyűjtünk 0,1 ml/perc sebességgel. A radio -aktivitást mutató frakciókat egyesítjük és 3 mól/liter koncentrációjú nátrium-acetát oldatot adunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a nátrium-acetát koncentráció 0,3 mól/liter legyen. Ezután 2,5 térfogat etanolt adunk a kombinált frakciókhoz, így a nukleínsavak kicsapódnak. 10 perces -70 °C hőmérsékleten végrehajtót hűtés után a mintát centrifugáljuk és a szupernatánst elöntjük. A kicsapódott nukleinsavakat 100 pl desztillált vízben feloldjuk. Ezután 20 pl 5 mól/liter koncentrációjú nátrium-hidroxid oldatot adunk az oldathoz. Az így nyert keveréket szobahőmérsékleten 40 percig hagyjuk állni. Ezután 10 pl 5 mól/liter koncentrációjú nátrium-ace-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
