196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
30 196455 31 (69) ACCGTTGTCAGC (70) AACGTCAGAGTG (71) ACCAGCGTTAAA (72) GTACTTCTTCAA (73) GTTTTCAGCTTC (74) CTTAACCTATCG (75) GTCTTGACAGTA (76) ACAACCCAAAGA (77) ACC CAAAACGAT AC AC AT G 6. lépés. A polinukleotid szintézise Az 5. lépés szerint nyert (1) és (2) oligonukleotidok mindegyikéből 40 pikomólnyit, és 6,5 egység T 4 DNS-kinázt helyezünk 25 jul, [S-32P] ATP-t (8 Ci/mmól) tartalmazó oldatba, amely oldat spermidinre 100 umól/liter, DTT-re 20 mmól/liter, magnézium-kloridra 10 mmól/liter, Tris-HCl-re (pH 9) 50 mmól/liter és EDTA-ra 0,1 mmól/liter koncentrációjú. A reakciót 30 percig hagyjuk lefolyni, amely által az (1) és a (2) összekapcsolódik (l)-(2)-vé. 2,5 térfogat etanolt adunk a reakciókeverékhez, ezáltal az oligomer kicsapódik. Az (1)—(2) elkülönítését 20%-os poliakrilamid gélen, 7 mól/liter koncentrációjú karbamid-oldatban végzett elektroforézissel végezzük el. (1)—(2) GATCCATGTGTATCG TTTTGGGTTCTTTG. A (3)-t és a (4)—t hasonló módon kötjük össze, igy nyerjük a (3)-(4)-et. A (3>—(4) elkülönítését hasonló módon végezzük el, ahogyan ezt az (l)-(2)-nél tettük. Az igy nyert (l)-(2)-t és (3)-(4)-et összekapcsoljuk, igy nyerjük az (1)—(2)—(3)— (4)—et- Ezt a műveletet ismételjük többször, ezáltal a következő DNS-eket nyerjük: (l)-(2)-(3)-(4)-(5)-(6)-(7)-(8)-(9)-(10)-(ll)—(12)—(13)—(14)—(15)—(16)—(17)—(18)—(19}—(20)— — (21)—(22)—(23)—(24)—(25)—(26)—(27 >—(28)—(29)— —(30)—(31)—(32)—(33)—(34)—(35)—(36)—(37)—(38)— -(39), és (40)—(41)—(42)—(43)—(44)—(45)—(46)—(47)— (48)— -(49)-(50)-(51)-(52)-(53)-(54)-(55)-(56)-(57)—(58)—(59)—(60)—(61)—(62)—(63)—(64)—(65)—(66)— —(67)—(68)—(69)—(70)—(71)—(72)—(73)—(74)—(75)— —(76)—(77). Az (l)-(39)-et és a (40)—(77)—et összekeverjük 50 ul TNE puffer oldatban. A keveréket egy-egy óra hosszat inkubáljuk 65 °C, majd 45 °C, majd 38 °C, végül 20 °C hőmérsékleten. Ekkor a keverékbe 20 pl, Tris-HCl-re (pH 7,5) 100 mmól/literes, kalcium-kloridra 100 mmól/literes, és magnézium-kloridra 100 mmól/literes oldatot adunk, majd 20 percig jégben hűtjük. 7. lépés. Klónozás Az A. J. Twigg és munkatársai által leirt [Nature, 283, 216 (1980)] módszerrel összhangban pAT 153 plazmidot készitünk. Az így nyert pAT 153 plazmidból lac promolorral és lac operátorral rendelkező pPM 50 plazmidot készitünk a Michael D. Edge és munkatársai által leirt [Nature, 292, 756-762 (1981)] módszerrel összhangban. 4 /ug pPM 50 plazmid DNS-t hasítunk Tris-HCl-re (pH 7,6) 10 mmól/liter, magnézium-kloridra 6 mmól/liter, nátrium-kloridra 150 mmól/liter és DTT-r 1 mmól/liter, koncentrációjú oldatban BamHI és SAL I restrikciós enzimekkel 60 percen ét 37 °C hőmérsékleten. A reakció befejezése után a DNS-t 3 : 1 térfogatarényú fenol-kloroform keverékkel extrahéljuk, és fragmenseket különítünk el elektroforézissel, az elektroforézist 1%-os agaróz gélen, Tris-HClre (pH 7,8) 40 mmól/liter, nátriumacetótra 6 mmól/liter, és EDTA-ra 1 mmól/liter koncentrációjú keverékben. A nagy fragmenst kinyerjük. 1 ug igy nyert BamHI-Sal I 3,2 kb vektor fragmenst összekapcsoljuk a 6. lépés szerint nyert kémiailag szintetizált génnel 0,4 egység T 4 DNS ligézt tartalmazó oldatban, amely oldat Tris-HCl-re (pH 7,6) 20 mmól/liter, magnézium-kloridra 10 mmól/liter, és DTT-re 10 mmól/liter koncentrációjú. A reakciót 16 órán át 12 °C hőmérsékleten hagyjuk lefolyni. Ennek eredményeképpen olyan DNS-t tartalmazó plazmidot nyerünk, amely DNS-ben a 6. lépés szerint nyert kémiailag szintetizált gén van összekapcsolva a laktóz-operon végével. Az így nyert plazmidot E. coli x 1776 törzzsel hozzuk érintkezésbe, ezáltal transzformáljuk az E. coli x 1776-ot. Az igy nyert transzformánsokat tenyésztjük, hogy DNS-t tudjunk belőlük kipreparálni. Az így nyert DNS-t a DNS dezoxinukleotid szekvenciára elemezzük az A. M. Maxam és munkatársai által leírt eljárással [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 560-564 (1978)]. Az eredmények azt mutatják, hogy az analizált szekvenciák megegyeznek az elméleti szekvenciával. A transzformánsok fermentlevének vírusellenes aktivitását vizsgáljuk, FS-4 sejteket és VSV-t alkalmazva fertőzést előidéző vírusként. (Az FS-4 sejteket és a VSV-t az 1. példa 9. lépése szerint alkalmazzuk). Az eredmények azt mutatják, hogy ez a fermentlé vírusellenes aktivitást mutat. (A plazmidnak az E. coli x 1776-ba beiktatásétól kezdve végzett kísérletsorozatokat az Asahi Kaséi Kogyo, K. K. P-3 jelű berendezésében vezettük le). 3. Példa. 1. lépés. Az mRNS készítése 10 liter, 1.10® sejt/ml limfocita koncentrációra beállított limfocita-tenyésztö tápközegbe 1 mg staphylococcus enterotoxin A-t (SEA) adunk, és a keveréket 2 napig 37 °C hőmérsékleten keverés mellett tenyésztjük. A limfocitákat 10 percig centrifugáljuk kis forgás-sebességű centrifugán 800 fordulat/perc forgóssebességgel. Az igy összegyűlt limfocitákat szuszpendáljuk 1 liter, 8 g nátrium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
