196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására

28

196455

29

centráljuk és n-hexánt teszünk hozzá, amíg a kívánt dimer nem rakódik ki por formájában.

2 mmól igy nyert dimert foszfát-vegyületté alakítunk ugyanolyan módon, ahogyan a

3. lépés első részében leírtuk. 3 mmól timidint teszünk az így nyert dimer-foszfát vegyülethez, és az igy nyert keveréket piridinnel azeotrop desztillációnak vetjük alá. A maradékot 20 ml piridinben feloldjuk. 3 ml TPSNI-t teszünk az így nyert piridines oldathoz, és a kondenzációt ugyanúgy hajtjuk végre, ahogyan a 3. lépés első részében leírtuk. 21 órával később a reakciót 2 ml 50 tömeg%-os vizes piridin-oldat hozzáadásával állítjuk le. 20 ml kloroformot adunk a keverékhez, majd ezt kétszer mossuk TEAB-val. Az oldószer bepái'lással történt eltávolítása után a kívánt trimert izoláljuk 60 g szilikagél alkalmazásával. A trimer teljes hozama 60%.

4. lépés. A védöcsoport eltávolítása a

trimerröl.

20 mg 3. lépés szerint nyert trimert oldunk fel 3 ml piridinben. 15 ml koncentrált vizes ammónia-oldatot helyezünk a fenti piridines oldathoz, dugóval lezárjuk az edényt és 19 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a reakciókeveréket 55 °C hőmérsékleten 5 órán át melegítjük, ezzel az ammóniát kidesztilláljuk. A reakciókeverékhez 20 ml 80 térfogat%-os vizes ecetsav-oldatot adunk, majd az ecetsavat kidesztilláljuk. A reakciókeveréket toluollal azeotrop desztillációnak vetjük alá, és a maradékot 25 ml 0,1 mól/1 koncentrációjú vizes TEAB oldatban feloldjuk, háromszor 25 ml kloroformmal, majd 25 ml dietil-éterrel mossuk. Az így nyert oldatokat az oldószer eltávolítása érdekében bepároljuk, és a maradékot 16 ml, Tris-ecetsav pufferre (pH 8,0) 20 mraól/literes, karbamidra 7 mól/literes oldatban feloldjuk. Az így nyert keveréket DEAE cellulózzal töltött oszlopra visszük, és só-gradienst (500 ml 0,05 mól/literes nátrium-klorid oldatból és 500 ml 0,40 mól/literes nátrium-klorid oldatból összeállítva) is tartalmazó, karbamidra 7 mól/liter, Tris-HCl-re (pH 8) 0,02 mól/liter koncentrációjú oldattal eluáljuk. Az eluátum megfelelő csúcs-abszorpciót mutató frakcióit összegyűjtjük, igy nyerjük a trimert.

5. lépés. Az oligonukleotid szintézise.

Az oligodezoxiribo nukleotidokat ugyanolyan módon állítjuk elő, ahogyan azt a 3. lépésben leírtuk. A védócsoportokat ugyanolyan módon távolitjuk el, ahogyan azt a 4. lépésben leírtuk, ilyen módon a következő oligodezoxiribo nukleotidokat nyerjük:

(1) GATCCATGTGTATCGTT

(2) TTGGGTTCTTTG

(3) GGTTGTTACTGT

(4) CAAGACCCATAC

(5)

G

T

T

A

A

G

G

A

A

G

C

T

(6)

G

A

A

A

A

C

T

T

G

A

A

G

(7)

A

A

G

T

A

C

T

T

T

A

A

C

(8)

G

C

T

G

G

T

C

A

C

T

C

T

5

(9)

G

A

C

G

T

T

G

C

T

G

A

C

(10)

A

A

C

G

G

T

A

C

T

T

T

G

(11)

T

T

T

T

T

G

G

G

T

A

T

C

(12)

T

T

G

A

A

G

A

A

C

T

G

G

(13)

A

A

G

G

A

A

G

A

A

T

C

T

10

(14)

G

A

C

A

G

A

A

A

G

A

T

C

(15)

A

T

G

C

A

A

T

C

T

C

A

A

(16)

A

T

C

G

T

T

T

C

T

T

T

T

(17)

T

A

C

T

T

T

A

A

G

T

T

G

(18)

T

T

T

A

A

G

A

A

C

T

T

T

15

(19)

A

A

G

G

A

C

G

A

C

C

A

A

(20)

T

C

T

A

T

C

C

A

A

A

A

G

(21)

T

C

T

G

T

T

G

A

A

A

C

T

(22)

A

T

C

A

A

G

G

A

A

G

A

C

(23)

A

T

G

A

A

C

G

T

T

A

A

G

20

(24)

T

T

T

T

T

T

A

A

C

T

C

T

(25)

A

A

C

A

A

G

A

A

G

A

A

G

(26)

A

G

A

G

A

C

G

A

C

T

T

T

(27)

G

A

A

A

A

G

T

T

G

A

C

T

(28)

A

A

C

T

A

C

T

C

T

G

T

T

25

(29)

A

C

T

G

A

c

T

T

G

A

A

C

(30)

G

T

T

C

A

A

A

G

A

A

A

G

(31)

G

C

T

A

T

C

C

A

C

G

A

A

(32)

T

T

G

A

T

C

C

A

A

G

T

T

(33)

A

T

G

G

C

T

G

A

A

T

T

G

30

(34)

T

C

T

C

A

A

G

C

T

G

C

T

(35)

A

A

G

A

C

T

G

G

T

T

A

A G

(36)

A

G

A

A

A

G

A

G

A

T

C

T

(37)

C

A

A

A

T

G

T

T

G

T

T

T

(38)

A

G

A

G

G

T

A

G

A

A

G

A

35

(39)

G

C

T

T

C

T

C

A

A

T

A

A G

(40)

T

C

G

A

C

T

T

A

T

T

G

A G

C T

T

C

T

(41)

A

C

C

T

C

T

A

A

A

C

A

A

(42)

C

A

T

T

T

G

A

G

A

T

C

T

40

(43)

C

T

T

T

c

T

C

T

T

A

C

C

(44)

A

G

T

C

T

T

A

G

C

A

G

C

(45)

T

G

G

A

G

A

C

A

A

T

T

C

(46)

A

G

C

C

A

T

A

A

C

T

T

G

(47)

G

A

T

C

A

A

T

T

C

G

T

G

45

(48)

G

A

T

A

G

C

C

T

T

T

C

T

(49)

T

T

G

A

A

C

G

T

T

C

A

A

(50)

G

T

C

A

G

T

A

A

C

A

G

A

(51)

G

T

A

G

T

T

A

G

T

C

A

A

(52)

C

T

T

T

T

C

A

A

A

G

T

C

50

(53)

G

T

C

T

C

T

C

T

T

C

T

T

(54)

C

T

T

G

T

T

A

G

A

G

T

T

(55)

A

A

A

A

A

A

C

T

T

A

A

C

(56)

G

T

T

C

A

T

G

T

C

T

T

C

(57)

C

T

T

G

A

T

A

G

T

T

T

c

55

(58)

A

A

C

A

G

A

C

T

T

T

T

G

(59)

G

A

T

A

G

A

T

T

G

G

T

C

(60)

G

T

C

C

T

T

A

A

A

G

T

T

(61)

C

T

T

A

A

A

C

A

A

C

T

T

(62)

A

A

A

G

T

A

A

A

A

A

G

A

60

(63)

A

A

C

G

A

T

T

T

G

A

G

A

(64)

T

T

G

C

A

T

G

A

T

C

T

T

(65)

T

C

T

G

T

C

A

G

A

T

T

C

(66)

T

T

C

C

T

T

C

C

A

G

T

T

(67)

C

T

T

c

A

A

G

A

T

A

C

C

65

(68)

C

A

A

A

A

A

C

A

A

A

G

T

16