196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
26 196455 27 centréljuk csökkentett nyomáson. Ezután azonos mennyiségű vizet adunk a koncentrált oldathoz, és a benzoesavat kivonjuk belőle dietil-éteres extrakcióval. A vizes fázist koncentráljuk és vízzel azeotrop desztillációnak vetjük alá, így N-benzoil-dezoxiadenozin(dbzA) rakódik le. Az így nyert N-benzoil-dezoxiadenozinhez kis mennyiségű piridint teszünk, és az igy nyert keveréket, miután egy éjszakán át hűtőszekrényben hagytuk állni, szűrjük, és ilyen módon a lerakodott kristályokat kiszűrjük. Az igy izolált kristályokat 5 tőmeg%-os vizes piridin-oldattal, majd dietil-éterrel mossuk. Végül 35 mmól dbzA-t nyerünk. A dbzA teljes kitermelése 70%. B. A dbzC szintézise 100 mmól dezoxicitidint (dC) szuszpendálunk 500 piridinben. 1 ekvivalens trietil-amint adunk az igy nyert szuszpenzióhoz, majd 30 percig keverjük. 6 ekvivalens benzoil-kloridot adunk hozzá jéggel történő hűtés közben. Ezután ugyanazokat a műveleteket ismételjük meg, amelyeket az A. lépésnél alkalmaztunk, ezáltal a dC benzoilezése történik meg. A kloroform eltávolítása után viszszamaradt maradékot 1250 ml tetrahidrofuránból, 1 liter metanolból és 250 ml vízből álló keverékben oldjuk. 250 ml 2 n nátrium-hidroxidot adunk az így nyert oldathoz jéggel történnő hűtés és keverés közben. 10 perc múlva a keveréket 250 ml 2 n vizes sósavoldat hozzáadáséval semlegesítjük. A továbbiakban ugyanazokat az eljárásokat ismételjük meg, amelyeket az A lépésben alkalmaztunk. Végül N-benzoil-dezoxicitidin (dbzC) válik ki. C. A dibG szintézis 100 mmól dezoxiguanozint (dG) szuszpendálunk 500 ml piridinben. 6 ekvivalens izobutil-kloridot adunk hozzá cseppenként jéggel történő hűtés közben. Az így nyert reakciókeveréket, miután 3 óra hosszat 0 °C-on kevertük, ugyanolyan kezelésnek vetjük alá, mint amelyet a B. lépésben alkalmaztunk, igy a dG izobutilezését elvégezzük. A kloroform eltávolítása után visszamaradt maradékot 500 ml etanolban feloldjuk, majd 500 ml 2 n nátrium-hidroxidot adunk hozzá 0 °C hőmérsékleten, és további 15 percig keverjük. Az igy nyert keveréket 1 liter hűtött, piridinium-tipusú kationcserélő gyantára öntjük (Dowex x 50 x 2, gyártja a Dow Chemical Co., Egyesült Államok), igy végezzük el a semlegesítést. Az igy semlegesitett keveréket kis mennyiségű fentemlitett gyantával töltött oszlopra visszük, és a gyanta-töltet háromszoros térfogatának megfelelő mennyiségű 10 tömeg/térfogat%-os vizes piridin-oldattal mossuk. Az eluátumot és a mosófolyadékot egyesítjük, koncentráljuk, és a maradékot 500 ml 5 Lömeg/térfogat%-os vizes piridin-oldatból átkristályositjuk. 2. lépés. 5'-dimetoxi-tritilezés 100 mmól timidint illetve 100 mmól dbzA-t, illetve 100 mmól dbzC-t illetve 100 mmól ditG-t összekeverünk 200 ml illetve 400 ml illetve 400 ml illetve 750 ml piridinnel. Az 'egyes keverékekhez 1,1 ekvivalens dimetoxi-tritil-kloridot adunk, és a reakciót 3 óra hosszat hagyjuk lefolyni. A reakciót 50 ml metanol hozzáadásával állítjuk le. Mindegyik keveréket koncentráljuk, 50 ml kloroformban feloldjuk, és vízzel mossuk. Az 5’-dimetoxi-tritil-timidin [(DMTr)T] izolálásához a reakciókeveréket bepároljuk az oldószer eltávolítás érdekében, majd toluollal azeotrop desztillálásnak vetjük alá, feloldjuk 1500 ml benzolban, melegítjük, ráadagolunk n-hexánt amíg a keverék zavarossá nem válik, majd 4 c‘C-on állni hagyjuk az átkristályositott (DMTr)T kinyerése érdekében. A (DMTr)dbzA illetve (DMTrldbzC illetve (DMTr)dibG izolálásához minden egyes keveréket bepárolunk az oldószer eltávolítása érdekében, a maradékot kloroformban feloldjuk és 1,5 kg szilikagélen kromatografáljuk, az elúciót 3 tömeg%-os vizes metanollal végezve. 3. lépés. Egy dimer és egy trimer szintézise. 6 mmól (DMTr)dG-t piridinnel areotrop desztillációnak vetjük alá, majd 10 ml piridinben feldoldjuk. 1,5 ekvivalens p-klórfenol foszfodikloridot teszünk cseppenként 1,5-2,2 ekvivalens triazol, 1,5-2,2 ekvivalens trietilanin és 20 ml dioxán keverékéhez, jeges fürdőben keverve, közben elkerülve a nedvesség bejutását. Egy órás keverés után a trietil-amin hidrokloridot kiszűrjük. A szőrieket a fentemlitett piridines oldathoz adjuk, közben elkerülve a nedvesség bejutását. Miután az oldószer kb 1/4 részét bepárlással elt.óvolítottuk, az oldatot egy óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 4 ekvivalens 1-metil-imidazolt és 8 mmól dibG-t teszünk hozzá és az így nyert keveréket piridinnel azeotrop desztillációnak vetjük alá. A maradékot 60 ml piridinben feloldjuk. 9 mmól TPS-nitroimidazolidot (TPSNI) táplálunk be az így nyert piridines oldathoz. Az így nyert keveréket egy negyed részére koncentráljuk, és egy éjszakán át állni hagyjuk 30 °C hőmérsékleten. A reakciót 6 ml, 50 tömeg%-os vizes piridin oldat beadásával állítjuk be. Az oldószer bepárlással történt eltávolítása után a keveréket 150 g 60-as típusú szilikagélk-1 (kako Junyanu Kogyo, K. K. Japán) töltött oszlopra bocsátjuk rá. Az így kialakult termeket 30 : 1 térfogat-arányú metilén-klorid-metanol keverékkel (amely még 1% piridint is tartalmaz) eluáljuk. Az eluétuinokat kon5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
