196453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak azonosítására
2 196453 3 A találmány tárgya eljárás nukleinsavak azonosításéra oldatban történő hibridizáléssal. A találmány szerinti eljárás során a hibridizációs reakcióban legalább két mintát alkalmazunk. A detektor-mintához jelzőanyagot kötünk, a másik, un. megkötőmintához (.capturing probe’) olyan komponenst kötünk, amely egy másik komponens iránt affinitással bir. így a hibridizálás eredményeként kapott megkötő-minta, cél-nukleinsav, detektor-minta hibrid a hibridizációs elegyben jelenlevő más komponensektől elkülöníthető. Nukleinsavak azonosításéra különböző hibridizációs eljárások használatosak. Példaként a közvetlen hibridizációs eljárást és a szendvics-hibridizációs eljárást említjük. A közvetlen hibridizációs eljárásban a nukleinsav minta oldatban van vagy szilárd hordozóhoz kötött. Az azonosítandó nukleinsavat jelzett minta segítségével mutatják ki. A szendvics-hibridizációs eljárásban (lásd a 4 486 539. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban) két külön mintát alkalmaznak, amelyeknek segítségével az azonosítandó nukleinsavat a mintaoldatból mutatják ki. A detektor-mintát jelzőanyaggal jelzik, a másik mintát szilárd hordozóhoz kötik. Olyan új hibridizációs módszert dolgoztunk ki, amelyhez két különböző mintát alkalmazunk, amelyek mindegyike oldatban van. Mivel mind a hibridizációban résztvevő cél-nukleinsav, mind a két minta azonos oldott fázisban van, a hibridizációs reakció lényegesen gyorsabban megy végbe, mint a szendvics-hibridizációs eljárás esetén, amelynél az egyik minta szilárd hordozóhoz kötött. A találmány szerinti eljárás során 1 óra inkubációs idő elegendő. Az egylépéses szendvics-hibridizáláshoz (lásd a 4 486 539. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban) legalább 12 óra hibridizációs idő szükséges. A kétlépéses szendvics-hibridizáláshoz [lásd a Dunn és Hassell, Cell. Vol. 12, 23-36 (1977) szakirodalmi helyen] legalább 24 óra hibridizációs idő szükséges. A találmány szerinti eljárásban előnyösen legalább két mintát alkalmazunk. A minták a cél-nukleinsavval kellően homológ nukleinsav fragmentumok. Előnyös, de nem szükségszerű, hogy a minták a meghatározandó nukleinsavban egymáshoz viszonylag közel lévő helyekkel monológok legyenek. A minták egymással nem lehetnek átfedőek. A mintákat szintetikusan, félszintetikusan, rekombináns - DNS technikával állítjuk elő vagy közvetlenül természetes forrásból izolált nukleinsavakat alkalmazunk. A minták több helyről kereskedelmi forgalomból is beszerezhetők. A mintát megfelelő vektorhoz is köthetjük, tartalmazhat vektorrészeket vagy vektorrészektól teljesen mentes lehet. A detektor-mintát megfelelő jelzőanyaggal jelezzük. Jelzőanyagként különböző radioaktív izotópokat vagy radioaktivan jelzett vegyületeket alkalmazhatunk. A jelzőanyag lehet még például fluoreszcens, lumineszcens vagy fényemittáló anyag és enzimes vagy immunológiai módszerrel kimutatható anyag is. A jelzőanyagokra példaként említhetjük a biotin- és avidin- vagy sztreptavidin-, lantanid a-kelál-, ferritin- és hem-vegyület - alapú anyagokat, az immunológiai módszerekkel kimutatható hapténeket, például acetoxi-acetil-fluorén-származékokat (WO 8302286). Az azonosítást végezhetjük fehérjék közvetítésével is. A találmány szerinti eljárást az alkalmazott jelzőanyag nem befolyásolja. Az eljárásban bármely, a nukleinsav hibridizáláshoz alkalmas, napjainkban ismert jelzőanyag használható. A másik mintához, az úgynevezett megkötő mintához hozzákötünk egy olyan komponenst, amely egy másik komponens iránt affinitással bir. Megfelelő affinitispárok a biotin és az avidin vagy sztreptavidin; a nehézfémszármazékok és a tioesoportok; a különböző homopolinukleotidok, így a poli dG és a poli dC; a poli dA és a poli dT; a poli dA és a poli U. De ezeken kívül más affinitáspárok is alkalmazhatók, feltéve hogy komponenseik egymás iránti aktivitása elég erős. Megfelelő affinitáspárokat találunk például az immunológiai módszerekhez használt ligandumok és konjugátumok között. Mielőtt a hibridizációs reakciót végrehajtanánk a vizsgálandó mintát úgy kezeljük, hogy a cél-nukleinsav szimpla szál formában legyen jelen a hibridizéló oldatban. A hibridizálást olyan hibridizáló elegyben hajtjuk végre, amely a eél-nukleinsavat, a jelzett-nrntát és a megkötőmintát tartalmazza, ha szükséges szimpla szálúvá alakitva. Hibridizáló oldatként különböző puffereket használhatunk. A hibridizálást 0-80 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 65 °C hőmérsékleten végezzük. Ha a hibridizáló oldat formamidot (40-55%) tartalmaz, a hibridizálást 37 °C-on végezzük. A hibridizáláshoz 1 óra idő elegendő. A hibridizálás befejezése után az oldatot kívánt esetben meghígitjuk, hogy az affinitáspárok számára kedvező körülményeket bi: tositsunk. Ezután az elegyet az affinitáspár második párjával hozzuk érintkezésbe. A megkötőminta, cél-nukleotid, detektor-minta hibrid összekapcsolására affinitás kromatogré'iás oszlopokat, szűrőket, műanyag- és üvegfelületeket használhatunk. Az affinitáskromatográfiás oszlop hordozóanyaga lehet például cellulóz, latex, poliakrilamid, dextrán vagy agaróz. Ezek az anyagok alkalmazhatók vizsgálócsövekben szuszpenzióként is. Előnyös az is, ha olyan vizsgé'ócsövet használunk, amelynek belső falához van rögzitve az affinitáspár másik komponense. A kiválasztott anyaggal szemben előfeltétel, hogy olyan komponenst lehessen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
