196453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak azonosítására
4 196453 5 hozzá kapcsolni, amely affinitással bir a megkötő-mintához kötött komponenshez. Ha a vizsgálandó minta az azonosítandó nukleinsavat tartalmazza, a detektor-minta, cél-nukleinsav, megkötő-minta hibridet nyerjük a hibridizálás eredményéül. A frakcionálás során ez a hibrid a hordozóhoz tapad. A frakciót jelző, a hordozóhoz tapadó anyagot ismert módszerekkel mérhetjük közvetlenül a hordozón vagy eluálást követően az eluátumból. A frakcionálásra az affinitáskromatogrófiás eljáráson kívül más módszerek is használhatók, például fázis extrahélás vagy mágneses mező. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákban mutatjuk be. A találmány szerinti eljárás nem függ a példákban használt nukleinsav fragmentumoktól. 1. Példa Adenovirus DNS azonosítása sejt-lizátumból homopolinukleotidok segítségéve] Detektor-mintaként 125J-tel jelzett mKTH 1206 rekombinéns fágot alkalmazunk, amely a 2. típusú adenovirus, a géntérképen 42-45,3% helyzetű adenovirus genomjának Bgl II-fragmentumát tartalmazza. A rekombináns fágot a .Deutsche Sammlung von Mikroorganismen' letéti helyen DSM 2827. szómon letétbe helyeztük. A rekombináns fág fajlagos aktivitása 7 ■ 107 cpm/pg DNS. A minta részletesebb ismertetése a Ranki és mtsai: Gene 21 77-85 (1983) szakirodalmi helyen található. Megkötő-mintaként a pKTH 1202 rekombináns plazmidot alkalmazzuk, amelyet a .Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen ’ letéti helyen a DSM 2824. számon helyeztük letétbe. A rekombináns plazmid a pBR322 plazmidba klónozott adenovirus BamHI fragmentumot tartalmaz (a géntérképen 29-42% helyzetű). A pKTH 1202 (DSM 2824) rekombináns plazmidot Hae III restrikciós enzim alkalmazásával fragmentáljuk, és a fragmentumok 3’ végeire poli A farkat kötünk terminális transzferáz enzim segítségével. A farok hosszát 3H-A beépítésével mérjük. A farok átlagos hossza körülbelül 70 A-egység. A megkötő-mintát felhasználás előtt forralással denaturáljuk. A vizsgálandó minta adenovírussal fertőzött A-549 sejteket tartalmaz. Az A-549 sejtek alveoláris epithelium folytonos sejtvonal sejtjei, az ATCC törzskatalógusban ATCC CCL 185 számon szerepelnek, és az ATCC törzsgyűjteményből beszerezhetők. A sejteket a befertőzést követően 21 órán át inkubáljuk. A sejteket ezután összegyűjtjük és 1%-os nátrium-dodecil-szulfét-oldat alkalmazásával lizáljuk. Az oldat 10® sejtet tartalmaz mililiterenként. Az oldat viszkozitását ultrahang kezeléssel csökkentjük. Kontrollként azonosan kezelt, nem fertőzött A-549 sejteket alkalmazunk. Hibridizálás előtt a vizsgálandó mintát 0,02 mól/l-es nótrium-hidroxid-oldatban 5 percig forraljuk, majd 0 °C-ra hűtjük, és ecetsavval semlegesitjük. A vizsgálathoz 500 000 cpm detektor-mintát, 50 ng megkötő-minta DNS-t és 10 /ul vizsgálandó mintát mérünk egy vizsgálócsőbe. Az elegy térfogatát 50 pl-re egészítjük ki, ehhez 0,6 mól/1 nótrium-kloridot, 0,06 mól/1 nátrium-citrátot, 0,02 mól/1 pH 7,6- -os nátrium-foszfátot és 0,5% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó puffert alkalmazunk. Az elegyet 1 órán ót 65 °C-on inkubáljuk. A hibridizáló oldatot ezután +20 °C-ra hűtjük és lassan átengedjük 1 ml oligo dT cellulózt tartalmazó kromatografálóoszlopon. Az áthaladt oldatot összegyűjtjük és ismét átengedjük az oszlopon. Ezután az oszlopot 20 ml 0,15 mól/1 nátrium-kloridot, 0,015 mól/1 nátrium-foszfátot (pH = 7,6) és 0,5% nátrium-dodecil-szufátot tartalmazó oldattal mossuk. A DNS kötését végül 1 ml 0,02 mól/l-es nótrium-hidroxid alkalmazásával bontjuk meg. Ezután meghatározzuk a kapott oldat radioaktivitását. Eredményeink a következők: 125J aktivitás (cpm) Cél-nukleinsav, Kontroll sejtek fertőzött sejtek 5230 325 2. Példa Chlamydia trachomatis DNS azonosítása biotin-sztreptavidin affinitáspár segítségével Detektor-mintaként 125J-tel jelzett mKTH 1245 rekombináns fágot alkalmazunk, amely a pKTH 1220 klón két Bam HI - Sal I DNS fragmentumát tartalmazza, és ezek együtt az M13mp8 vektorhoz kötöttek. A pKTH 1220 kiónt a .Deutsche Sammlung von Mikroorganismen' letéti helyen DSM 2825. számon helyeztük letétbe. A pKTH 1220 klón részletes ismertetése a Palva és mtsai: FEMS Microbiology Letters 23, 83-89 (1984) szakirodalmi helyen szerepel. Megkötő-mintaként a pKTH 1250 rekombináns plazmidot alkalmazzuk. Ez a plazmid a pKTH 1220 plazmid (DMS 2825). 2 900 b|zis Sáli - Clal fragmentumából és a pAT 153 vektorból áll. A biotinmolekulót a pKTH 1250 DNS-hoz kötjük kovalensen Rigby és mtsai, ismert módszerével (.nick transzláció') [J. Mól. Bioi. 113, 237-251 (1977)] és biotin-11- -UTP-t (Bethesda Kutató Laboratórium) alkalmazunk szubsztrótumként. A megkötő-minta DNS-t 1 mmól/1 EDTA tartalmú 10 mmól/l-es pH 7,6-os trisz-Cl pufferben 5 percig forraljuk felhasználás előtt. A célnukleinsav a pKTH 1220 rekombináns plazmid (DSM 2825). Ez a plazmid kó-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
