196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
12 196452 13 tumokkal hibridizáltuk. A hibridizálást úgy végezzük, ahogy azt az E példában leírtuk, de a hibridizáló oldathoz még 50 ug/ml poli(U)-t és 10 pg/ml poli(I) : poli(C)-t adunk és a szürőmembránt a hibridizélés utón 50%-os formamidban és 1 x SSC-ben mossuk. A PIAC kiónt ilyen módon analizáltuk, és csak saját magával hibridizált. G példa RNS-transzfer-hibridizációk Annak eldöntésére, hogy egy adott tridekanukleotid pozitiv baktérium klón tartalmazhat-e interferon kódoló szekvenciákat, megvizsgáljuk, hogy vajon Namalwa sejtekből származó Sendai vírussal indukált mRNS-el saját plazmid DNS-e hibridizál-e. E célból indukált és nem indukált Namalwa sejtekből, a B példában megadott módon, poli(A)*RNS-t izolálunk. Az izoíált anyagot egy órán át 50 °C-on történő inkubálással 1 M glioxál, 50% DMSO, 10 mM nátrium-foszfát puffer (pH = 7) elegyében denaturáljuk, majd 1,4%-os agaróz gélben elválasztjuk, s ezután az irodalomból ismert módszerrel [Proc. Kati. Acad. Sei. USA 77, 5201-5205 (1980)] nitrocellulóz szűrömembránra visszük fel, s nick-transzláció segítségével 32P-vel jelzett (lásd az F példát) plazmid-DNS-el hibridizáljuk. Az a plazmid DNS, amely indukált génből származik, ebben a kísérleti elrendezésben csak indukált sejtekből való RNS-el hibridizál, de nem indukált sejtekből származó RNS-el nem. A 4. ábra egy ilyen kísérlet autoradiográfiás képét mutatja be: egy párból az indukált RNS-t (,i') mindig a hasáb baloldalán, a nem indukált RNS-t (.n‘) a jobboldalán tüntetjük fel. A hibridizáláshoz a használt plazmid DNS P1A6 csak az indukált sejtekből származó RNS-el hibridizált. A PlA6-al hibridizáló RNS tömege 12-14S körül volt. Ezért a P1A6 plazmidot tovább vizsgáltuk, hogy interferon-DNS szekvencia tartalmát egyértelműen igazoljuk. H példa A P1A6 IFN-oC típusú klón analízise A P1A6 klón a vírussal indukált Namalwa-RNS-el a 12-14S régióban hibridizált (a G példában irtuk le). Egy körülbelül 900 bázispár hosszúságú cDNS-inszertumot tartalmazott, amely - restrikciós analízissel vizsgálva - a Bam HI, Bgl II, Eco RI, Hin dili, Pst I és Pvu II enzimmel nem volt hasítható (lásd az 5. ábrát). Annak bizonyítékát, hogy ugyanis a P1A6' kiónnak IFN-cC-kódoló szekvenciái vannak, a DNS-szekvencia analizis szolgáltatta: a P1A6 cDNS-inszertumának szekvenciáját az inszertumot határoló Pst I-hasitási helytől befelé vezettük le (lásd a 6. ábrát) és a Goeddel és munkatársai [Nature, 290, 20-26 (1981)] által leírt IFN-oC-szekvenciával hasonlítottuk össze. Megállapítottuk, hogy a P1A6 klón a LelFN C kódoló szekvencia 49 bázispárral rövidebb változatának felel meg. A P1A6 3’ végén jelenlevő poli(A)-szekvencia arra utal, hogy a P1A6 klón egy rövidebb mRNS-böl származik, mint a leközölt LelFN C klón. A LelFN C proteint kódoló régió azonban teljesen jelen volt. I példa Egy további IFN-oC-tlpusú klón (1F7) azonosítása és analízise A P1A6 volt az egyetlen olyan IFN-cC-tipusú klón, amelyet a 190 tridekanukleotid pozitiv klón gyűjteményéből (lásd az E példát) azonosítottunk. Hogy további IFN-cC-tlpusú kiónok jelenlétét deríthessük ki, az eredeti cDNS klónbankból (C példa) kolónia hibridizáció segítségével (ahogy az F példában leírtuk) 1800 kiónt hibridizáltunk a P1A6 klón cPN'S in szert urnával. Ezen a módon egy további IFN-oC kiónt (1F7) találtunk. Az ÍF7 cDNS inszertumának restrikciós analízise és részleges DNS-szekvencia analízise azt mutatta, hogy az 1F7 egy 175 bázispórral hoszszabb variánsa a LelFN A (Goeddel és munkatársai, lásd fent) klón típusnak. Az IF7- -nek ugyanúgy, mint a LelFN A kódolónukkotidnak a Bgl II-vel és Pvu II-vel (6. ábra) két hasítási helye van; a vizsgált DNS szekvenciákat az inszertum 5’ és 3’ végével a 6. ábrán mutatjuk be. A továbbiakban az 1F7 IFN-cC-tipusú klón DNS szekvenciájánnak részeit didezoxi módszerrel [Messing és munkatársai, Nuc. Acid. Res. 9, 2871 (1981) és R. C. Gardner és munkatársai, Nuc. Acid. Res. 9, 2871 (1981)], egy univerziális primerrel analizáltuk. A 120- —tói 323-ig terjedő pozícióban a következő rész-szekvenciákat találtuk: CCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCT CCTGCTTGAAGGACAGACGTGACTTTGGATTTCCCCA GGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACC ATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCA ATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGA TGAGACCCTCCTAGACAAATTCTA....... Összehasonlítva az IFN-oC A típus irodalomból ismert szekvenciáját [D. V. Goeddel és munkatársai, Nature, 290, 20 (1981)] az 1F7 új IFN-oC típusú DNS szekvenciájával, kitűnt, hogy a 120-323 nukleotidot felölelő tartományban a következő különbségek vannak: a 137. és 170. pozícióban az A nukleotidot mindig G nukleotid helyettesíti. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
