196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
14 19G452 15 3. példa Az 1F7 hibrid plazmiddal transzformált E. coli HB101 lizátumának interferon aktivitása Megvizsgáltuk a PlA6-al vagy lF7-el transzformált baktériumtenyészetek lizátumait biológiailag aktív interferon tartalomra nézve. 100 ml baktériumtenyészetet L-Broth táptalajon tenyésztettünk, 0,6-0,8 optikai denzités eléréséig, a tenyészetet 10 percig 7000 fordulat/perc mellett centrifugálással ülepítettük, egyszer mostuk 50 mM trisz-sósavat (pH = 8) és 30 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldattal, végül ugyanebben a pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenziót 1 mg/ml lizozimmel 30 percen ét jégfürdőben inkubáltuk, majd a baktériumokat ötször egymásutáni fagyasztással és felolvasztással tártuk fel. Ezután a sejttórmeléket 1 órán át 4000 fordulat/perc mellett történő centrifugálással távolitottuk el. A felülúszót sterilre szűrtük és plakk-redukciós módszerrel interferon aktivitásra vizsgáltuk. Az 1F7 klón ily módon kapott lizátumában ml-enként körülbelül 500 egység interferon volt kimutatható; a P1A6 klón ebben a vizsgálatban nem mutatott aktivitást, ami feltehetően arra vezethető vissza, hogy a plazmid-vektorban az inszertumnak más volt az orientációja. K példa Az 1F7 által kódolt interferon típus kifejeződésének fokozása DNS szinten három feltételnek kell teljesülnie, hogy egy génnek jó kifejeződését érjük el: először, a gén előtt egy protmoternek (egy RNS-polimeráz kötőhelynek) kell lennie, másodszor a transzláció iniciációs kodonja előtt a leolvasott RNS-nek egy riboszómakótó szekvenciát (RBS) kell hordoznia, harmadszor az RBS és az iniciációs kodon közti távolságnak megfelelő hosszúságúnak kell lennie. Az 1F7 által kódolt interferon kifejeződéséhez, mint pormoter szekvenciát a Serratia marcescen8 triptofán operonjának irodalomból ismert promoterét [Nature, 276, 684- -689 (19781) és mint RBS-t egy irodalomból ismert DNS szekvenciát [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 5543-5548 (19811) alkalmaztuk. Az lF7-nél az RBS és az iniciációs kodon közti optimális távolság meghatározásához a következő stratégiát választottuk: uz 1F7- -cDNS szekvenciát a kétszálú DNS-re specifikus BAL 31 exonukleázzal rövid ideig emésztettük, miáltal különböző hosszúságú molekulák keverékét kaptuk. Ezután ezeket a molekulákat szintetikus linker-szekvenciák segítségével megfelelő módon egy .expressziós-plazmid‘-ban megkötöttük, azaz egy olyan plazmidban, amely promotert és RBS-t tartalmaz. Ezzel a plazmiddal E. coli HB101 törzset transzformáltunk és az egyes transzformált sejtek interferon termelő képességét meghatároztuk. Ezt a kísérletet - részletezve - a következőképpen végeztük: 0,5-1 ug 1F7 inszertumot 100 ul 20 mM trisz-sósav (pH = = 8,1), 0,6 M nátriuni-klorid, 12 mM magnézium-klorid és 1 mM EDTA tartalmú elegyben 3 percig 30 °C-on 0,5 egység BAL 31-enzimmel (Eethesda Research Laboratories) inkubáltunk. A reakciót ezután 300 ul 15 niM-os EDTA oldat (pH = 7,8) hozzáadásával leállítottuk, a reakciókeveréket 10 percig 65 °C-on melegítettük, fenollal és éterrel extraháltuk és etilalkohollal kicsaptuk. A csapadékot 10 ul 70 mM trisz-sósav (pH = 7,5), 7 m.M magnézium-klorid, 1 mM DTT és 4 mM ATP tartalmú elegyben 30-60 pMol foszforilált Hind lll-linkerrel (Bethesda Research Laboratories) egy éjszakán át 14 °C-on inkubáltuk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy az elegyet 10 percig 65 °C-on tartottuk, hozzáadtunk 2 M ammónium-acetátot és az interferon gént a kötetlen Tinkerektöl 0,6 térfogat izopropanollal történő kicsapással tisztítottuk meg. A csapadékot 30-50 ul 33 mM trisz-acetát (pH = = 7,9), 66 mM kálium-acetát, 10 mM magnézium-acetát és 100 ug/ml BSA tartalmú elegyben oldottuk fel és 30-50 egység Hind Ill-al 2-3 órán át emésztettük. A reakciót 10 percig 65 °C-ra történő hevítéssel állítottuk le, azután a reakció elegyhez hozzáadtunk 2 m ammónium-acetátot és az interferon gént 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki. A csapadékot 10 ul 70 mM trisz-sósav (pH = 7,5), 7 mM magné2ium-klorid, 1 mM DTT és 0,5 mM ATP tartalmú elegyben oldottuk és 10-2 egység T4 ligáz segítségével egy éjszakán ét 14 °C-on 0,2 ug Hind III-al linearizélt, foszfáttal kezelt pER103 expressziós plazmidhoz kötöttük. A pER103 egy pBR322-származék, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter szekvenciáját és egy irodalomból ismert RBS-t tartalmaz (lásd fent); a Hind III-al az RBS közelében linearizálható. Az igy kapott piazmidokat az E. coli HB101 transzformálására használtuk fel és az egyes transzformált sejtek interferon termelő képességét a J. példában leirt módon vizsgáltuk. igy az interferon kifejeződésének 104- -szeres értékű fokozását értük el a spontán expresszióhoz képest. Mintaként a következő mikroorganizmusokat és rekombináns DNS molekulákat helyeztük letétbe 1982 május 17-én a .Deutsche Sammlunk von Mikro-Organismen' (Griesebach Strasse 8, 3400 Göttingen) intézménynél az alábbi DSM-számok alatt: 2362 (1F7), 2363 1P1A6). Ezek a mikroorganizmusok és rekombináns DNS molekulák a budapesti szerződés 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
