196435. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pankreatin kinyerésére
5 196435 6 vagy - olyan esetekben, amikor a szubsztrótum kémiailag nem kielégítően ismert - percenként 1 mikromol illetve 1 mikroekvivalens reakcióterméket állít elő. Az egyes enzimek meghatározásánál használt külső feltételeket a könyv n 21-84. oldalon ismerteti. A FlP-egységet tehát katalizált kezdeti reakciósebesség értékekből határozzuk meg, és ezáltal ezeket az értékeket gyorsabban (és pontosabban) megkapjuk, mint az előbb tárgyalt NF-szorzófaktorok érLékeit. Egy, a FlP-egységeknek NP-szorzófaktorokra (kísérletileg) való átszámolási táblázatot az alábbiakban közlünk, ami a lipáz-egységeket is tartalmazza annak ellenére, hogy az NF XIII lipán-meghatározést nem közöl. Ezért feltesszük, hogy egy pankreatinkészilmény, amelyik ainilázra nézve például 6 • NF minőségűnek bizonyul, a proteézokra és a lipázra nézve is 6 • NF minőségű, azaz az enzimek aktivitásarányát a természetes sertéshasn.válmirigy ben és a belőle készült pank reatinkészilmény ben állandónak tekintjük. A gyakorlati haszon az NF-szorzófaktorok használatánál az, bogy a pankreatinban lévő összes enzim aktivitását egyetlen egy szám jelzi. Tapasztalat szerint megfelel: 1 • NF = 6250 FlP-eg,vség/g pankreatinamiláz 1 • NF = 5000 FlP-egység/g pankreatinlipáz 1 • NF = 375 FlP-egvség/g pankreatintripszin 1 ■ NF = 1250 FlP-egység/g pankreatinkimotripszin A F1P értékek megduplázása az NF-szorzófaktorok megduplázásét jelenti, és így tovább. Azoknál az ismert eljárásoknál, amelyek autolizátumból indulnak ki, a pankreatin sohasem vélik ki olyan formában, hogy a további feldolgozása problémamentes legyen. Olyan eljárások, amelyek a hasnyálmirigyből közvetlenül nyerik ki a pankz-eatint, és főleg n nagy l.érfogatsúlyú pankreatint, szőkébb értelemben nem léteznek, az előbb említett .lipázban gazdag enzimkészitmény * előállításával kell számolni, és amelyek ugyanakkor jelentékeny technikai felszereltség mellett 3 különböző oldószerrel dolgoznak. A találmány feladata ezért a lehető legegyszerűbb és legveszélytelenebb eljárás megadása, amivel nagy technikai felszereltség nélkül, teljes enzimkinyerés mellett a legnagyobb enzimaktivitású és szabad proteáztartalmű pankrealinl nyerjük, amelyik ezenkívül csiraszegény, könnyen szétesik, nagy térfogatsúl.vű és rostmentes, és amelyik gyakorlatilag enzimveszteség nélkül feldolgozható és raktározható, és a lényeges lépései n vizes, adott esetben kalciumion tartalmú hasn.válmirigy-szövetpép illetve vizes szövetszuszpenzió aulolizálása, a rostanyagok eltávolítása, valamint adott esetben víztelenítés, zsirtalanilás, kicsapás és a kapott csapadék szárítása. 4 Ezt a feladatot a talámány szerinti módon úgy oldjuk meg, hogy az autolizist a szuszpenzióra vonatkoztatva legfeljebb -20 tömegszázaléknyi izopropanol hozzáadása mellett, 6,5-8,5 pH értéknél, előnyösen 6,5-7,5 pH értékre beálló puffer, például a bevitt mirigyszövet súlyára vonatkoztatva legfeljebb 3%, de különösen 1-1,5% alkálifém-hidrogén-karbonát jelenlétében, adott esetben kismennyiségű kalciumsó jelenlétében, 30 °C alatti hőmérsékleten végezzük, és az autolizist megszakítjuk, mihelyt az autolizátumból kivett próbaminta 55-65%-os vizes izopropanolban a 3-10 mm/1-3 perc ülepedési sebességet eléri. Az adat a földi nehézségi, tehát nem centrifugális erőtérben való ülepedési sebességre vonatkozik. Az autolizis befejeződik izopropanolnak az autolizétum főtömegéhez, a víz és izopropanol összsúlyára vonatkoztatott 30-35 tömegszázalékig való adásával, az erre híganfolyóssá váló autolizátumot a kötószöveti rostoktól leszűrhetjük. A szúrlelel 15-25 °C-on izopropanoilm ontjuk úgy, hogy megint csak a víz és az izopropanol összsúlyéra vonatkoztatva 55-65%-os oldat keletkezzen, amiből a pankreatin durvaszemcsés formában kiválik és rögtön leülepszik. Az anyalúg dekantálása után a kiülepedett pankreatint izopropanollal való többszöri felkeveréssel és ülepítéssel zsir- és triptonmentessé mossuk. (A tripton tripszin hatására proteinből képződött peptonl. A csapadéknak végül 70-85 tömegszézalék - előnyösen 75-76 súlyszázalék - izopropanol koncentrációjúnak kell lennie, és leszívatással vagy kícentrifugáléssai, előnyösen csökkentett nyomáson és száraz levegővel (például 20 °C-on kisebb mint 20% relatív nedvességtartalom) vagy nitrogénnel való kezeléssel megszárítjuk. A csapadék fentiekben leírt mosását izopropanol helyett acetonnal is végezhetjük. A vizes oldatok illetve anyalúgok alkoholtartalmára vonatkozó előbbi adatoknál, amennyiben a bevitt nyersanyag súlyát beszámítjuk, a víztartalmai 63 tömegszázaléknak tételezzük fel. A csapadéknak az utóbb megadott izopropanol végkoncentrácíó jónál figyelembe kell venni, hogy az egyensúly beállása a csapadék és az anyalúg között nagyon sokéig tarthat, mivei a fehérjék a vizet nagyon makacsul megkötik, és ezért a kiuJepedell részecskéken beiül vízben gazdag fázis van. Ezért a végkoncenlrációadatok nem az oldatfázis analitikai összetételére vonatkoznak, hanem mint az előbb megadtuk, számítoltak. A találmány szerinti eljárást gyakorlatilag a következőképpen végezzük: A foszlatott vagy megdarált hasnyálmirigyhez a jobb keverhelöség céljából 20-80%-os vizet adunk. Az autoiizis folyamatét 1- -1,5% nátrium-hídrogén-karbonói. hozzáadásával kíméletesen, tehát anélkül, hogy az enzimek károsodnának, a kívánt módon vezetjük 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
