196379. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új indeno-pirimidin származékok előállítására
15 196379 16 A tesztvizsgálat negyedik napján minden vizsgált vegyülettel kezelt állatnak és a kontroll állatok felének 1,0 rag tesztoszteron-propionát szubkután injekciót adtunk gabonaolajban. A többi kontroll állat azonos térfogatú gabonaolajat kapott. A tesztvizsgálat hetedik napján a tesztoszteron-propionáttal kezelt patkányoknak 100 mikroCi/3H/-tesztoszteront adagoltunk szubkután úton 50 mikről fiziológiás sóoldat-etanol (3:1) elegyben. Két óra múlva az állatokat lefejeztük. A méhet eltávolitottuk és eltávolítottuk a külső kötőszövetet majd megmértük. A gabonaolajjal kezelt állatok méhének tömege kicsi volt és negativ vagy nem stimulált kontrollként szerepeltek. A tesztoszteron-propionáttal kezelt kontroll állatokban az aromatizációval keletkező ősztrogének stimulálták a méhet és tömegnövekedést okoztak. Azok a vegyületek amelyek inhibiálják az aromatizálást sokkal alacsonyabb méhtómeget eredményeztek, mint a tesztoszteronnal kezelt kontrollok méhsúlya. A /3H/-tesztoszteronnal kezelt patkányok ^ petefészkét kivágtuk, a külső szövettől megtisztítottuk és 2,5 ml 1,0 mmólos káliumfoszfáttal, amely 3,0 mmól MgCl2.6H20-t, 320 mmól szukrózt és 0,25% Triton X-100-at (polietilénglikol-p-izooktil-fenil-éter; Rohm and Hass) tartalmaz, 6,6 pH-n homogenizáltuk. A petefészek szteroidokat 1,5 ml 9:1 arányú eoluoletanol eleggyel extraháltuk, amelyhez 25- -100 mg ösztradiol, ösztriol és ösztron anyagot valamint körülbelül 1000 dpm /14H/-ösztradiolt adtunk. A mintákat 500 x g erővel centrifugáltuk 10 percig, majd a szerves fázist egy kónikus edénybe öntöttük. Két további extrakciót végeztünk ugyanilyen módon. Az egyesített szerves extraktumot bepároltuk és vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá. A petefészek fehérjéket 5,0 ml etanol hozzáadásával a maradék vizes fázisból kicsaptuk. A mintákat éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk, majd 1500 x g erővel 10 percig centrifugáltuk. A felúszót eldobtuk és az üledéket 0,3 n kálium-hidroxidban oldottuk. A fehérjetartalmat Bradford, Analytical Biochemistry, 72, 248 /1976/ módszere szerint ® meghatároztuk. Minden fenti extrakció szerves maradékát 9:1 arányú diklórmetán-metanol elegyben újraoltottuk. Minden minta oldatát fluoreszcens jq indikátort tartalmazó szilikagélen vékonyrétegkromatográfiásan komponenseire választottuk. A kromatográfiás lapokat az első dimenzióban 160:38:1,5:0,5 diklórmetán/etilacetát/metanol/ecetsav eluens alkalmazásával a lap tetejétől 3 cm magasságig kifejlesztettük. Ezután levegőn megszárítottuk majd a második dimenzióban 180:19:1 diklórmetán/metancl/ammóniumhidroxid eluens alkalmazásával kifejlesztettük. A lapot levegőn megszáritottuk és 254 nm UV lámpa alatt megvizsgáltuk. A látható foltokat bejelöltük és a lapot primulinnal (0,001% 4:1 arányú aceton/víz elegyben) Wright módszere szerint (J.Chromatography, 59, 220 /1971/) előhívtuk. Ezt további szteroidok meghatározását teszi lehetővé 365 nm UV fény segítségével. A foltokat egy lapról egy üveggyapottal bedugott Pasteur pipetta segítségével vákuummal eltávolitottuk. A szteroidokat 2,0 ml diklórmetán majd ezt követően kétszer 2 ml metanol alkalmazásával közvetlenül szcintillációs csövekre eluáltuk. A szerves oldószert elpárologtattuk, majd 10,0 ml szcintillációs folyadékot (Beckman Ready Solv-NA) adtunk a mérőcsövekbe. A mintákat folyadék szcintillációs spektrometriásan analizáltuk és a /14H/-szteroid visszanyerés alapján korrekciót végeztünk. A 2. táblázatban közöljük a mért méhtőmeget a tesztelt anyaggal kezelt (DT), a nem stimulált gabonaolaj kontroll (UC) és a stimulált gabonaolaj kontroll (SC) állatok esetében %=100(DT-UC)/(SC-UC) értékben adjuk meg. Az ősztrogének értékeit a tesztoszteron-kezelt kontroll állatok értékeinek százalékában adjuk meg. 2. táblázat Vegyület példa szám Dózis* Méhtömeg % szteroid Koncentráció' tömeg%** ösztradiol ösztron 1 3 50.2* 31.5* 31.5 10 37.3* 17.2* 31.4 30 20.6* 23.6* 117.9 2 3 49.1* 40.5* 106.3 30 33.3* ' 19.4* 83.2 4 3-14.3* szennyeződött 30-35.5* minták 5 3 47.3* szennyeződött • 30 22.8* minták 9
