196379. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új indeno-pirimidin származékok előállítására
13 196379 14 0,421 g 60%-os olajos nátriumhidrid szuszpenziót adunk. Azonnal kékes-bíbor szinüvé válik az elegy. A reakcióelegyet éjszakén ót szobahőmérsékleten keverjük. Vékonyrétegkromatográfiás analízis (9:1, toluolretilacetát, 2x kifejlesztés) szerint a kiindulási anyag eltűnt az elegyból és egy kevéssel magasabb Rt értékű termék, valamint a startponthoz közel eső Rf értékű termékek keletkeztek. A reakcióelegyet jégre öntjük majd etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos fázist telített sóoldattal mossuk, magnéziumszulfáton megszáritjuk majd bepároljuk. Barna olajat kapunk, amelyet 500A preparatov oszlopkromatográfia segítségével gradiens elúciót alkalmazva (3 1 10% etilacetát tartalmú toluol, majd 3 1 30% etilacetát tartalmú toluol eluens alkalmazásával) tisztítunk. 200 ml-es frakciókat gyűjtünk. A 8-11. frakciókat bepároljuk és 0,76 g címbeli terméket kapunk, 24% termelés. Etil— acetát/izooktán elegyból kristályos terméket nyerünk ki, 0,42 g (13,4%), o.p.: 147-8 °C. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek alkalmasak ösztrogén függő betegségek, mint például mellrák, emlösökbeni kezelésére illetve megelőző kezelésére, mivel aromatáz enzim inhibiáló hatással rendelkeznek. A vegyületekról kimutatták, hogy sokkal kevésbé hajlamosak a májgyulladás mikroszómás enzimjeinek növekedését előidézni mint a cythchrome P-450. Az aromatáz enzim inhibiáló készséget Brodie és munkatársai J.Steroid Biochem., 7, 787 /1976/ publikációjában közölt izolált patkány petefészek mikroszóma módszerének módosított változatával végeztük. Ebben az eljárásban a petefészek mikroszómákat terhes kanca-szérum gonadotrop hormonnal kezelt patkányokból nyertük. A vizsgált vegyúleteket 0,1 mikromól 4-androsztén-3,17-diont, 100,000 dpm l,2/3H/-androsztén-diont, mikroszómákat és NADPH termelő rendszert tartalmazó reakció fiolákba adagoltuk. A vizsgált inhibitorok koncentrációja 5 és 10 000 nmól közötti volt. Ebben a reakcióban az androsztén-díon aromatízálódása /3H/-H20 keletkezését eredményezi, amelyet a minták kloroformmal történő extrakciójóval és a vizes fázis aktiv szénnel való kezelésével - amely eltávolítja a szabad szteroidokat - izolálunk. A mintákat folyadékszcintillációs spektrométerrel analizáltuk és az inhibiálás százalékát az inhibitor nélkül inkubált mintákkal való összehasonlítás alapján állapítottuk meg. Az inhibiálási potenciált úgy határoztuk meg, hogy megadtuk mekkora nanomól koncentrációra van szükség az 50%-os enzim aktivitás inhibiáláshoz (ECso) amennyiben a szubsztrát (androsztén-dion) koncentráció 0,1 mikromól. Bizonyos (I) általános képletű vizsgált vegyületek ECso adatait az 1. táblázatban soroljuk fel. 1. táblázat Patkány petefészek mikroszóma kísérletben meghatározott aromatáz inhibiáló hatás Vegyület példa száma ECso* 1 24 2 21 3 21 4 27 5 50 6 24 7 84 8 63 9 < 50 10 84 11 < 50 12 128 13 61 14 86 15 < 50 16 < 50 17 750 18 26 19 255 20 420 21 < 50 22 50 23 265 24 69 25 500 26 118 27 72 28 35 29 40 30 40 * a 0,1 mikromól szubsztrát koncentráció mellett az aromatáz enzim aktivitásának 50%-os inhibiálásához szükséges vizsgált vegyület koncentráció nanomólban. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek inhibiálják az aromatáz enzimet és ennélfogva alkalmasak emlősökben ösztrogének szintézisének inhibiálására. Ezen tulajdonságukból eredően a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek alkalmasak ösztrogén függő betegségek, mint például mellrák kezelésére. Ezt az in vivo aktivitást az alábbi teszt-vizsgálatban mutattuk ki. Patkányokbani ösztrogén szintézis inhibiáló hatás Fejletlen Wistar nőstény patkányokat (45- -55 g) 2-8 állatot tartalmazó kontroll és tesztvizsgálatnak alávetett csoportokra osztottuk. A vizsgált vegyúleteket gyomorszondán ét gabonaolajban adagoltuk hét napon át naponta az állatoknak. A kontroll állatok gabonaolajat kaptak a tesztelt vegyület nélkül. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 8
