196312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aktivált polimer-anyagú hordozó előállítására
11 196 312 12 A 17. példában leírtak szerint 5 ml gyöngycellulózt amino-propil-trieloxi-szilán és glicidoxi-propil-trietoxi-szilán keverékével 2 órán át rázunk szobahőmérsékleten, majd a felesleges reagenst leszívatjuk, a hordozót niegszárítjuk, 0,1 mólos foszfát-pufferral alaposan átmossuk, (pH = 6,8), majd 3 % glutáraidehiddel, végül a 19. példában leírtak szerint 135,1-lgG-vcl reagáltatjuk. A hordozó fehérje-koncentrációja 26,4 mg 135 J-IgG/ml gyöngycellulóz. 22. példa 23. példa A 19. és 22. példák szerint előállított 135J-lgG-tarlaltrní hordozót háromszor 20-20 ml PlJS-piiffcrral mossuk, (pH = 7,4, dioxánt is tartalmaz), majd a megkötött fehérje menyiségét radioaktív úton mérjük, a kapott értékek, 11,4 mg/ml (19. példa), ill. 26,6 mg/ ml (22. példa), változatlan értékek. 24. példa A 19., 22. és 23. példákban alkalmazott IgG-t nyulakból alkalikus foszfatáz enzimmel történő immunizálással nyertük. Ennek megfelelően alkalmasak a megfelelő antitest aktivitás kihasználásával alkalikus foszfatáz enzim tisztítására és izolálására. E célra a 19. példa szerint előállított 125J-IgG-vel reagáltatott alkalikus foszfatáz enzimet kötünk, majd pH = = 11,4-nél trietil-aminnal eluáljuk. Az így tisztított enzim aktivitása 1000 IU/mg, kitermelése 80 % és poliakrilamid-elektroforézissel kísérő fehérje nem mutatható ki. kus kötések meghatározását a megfelelő nyül-normál szérum felvitelével, valamint az összes antitest-tartalmú frakciók poliakrilainid-diszk-clcktroforézisével végezzük. 5 26. példa Lap alakú cellulóz-hordozót (Whatmnn-Papicr 540 10 és FN 4-Papier) 3 %-os amino-propil-trietoxi-szilánnal vagy glicid-oxi-propil-szilánnal kezelünk a 19. és 20. példában leírtak szerint, majd 131 J-humán-szérumalbuininna! (I3IJ-HSA) kezelünk 0,1 mólos foszfátpufferban (pH = 6,8). A fehérje koncentrációja 15 10 Mg/ml, ill. 100 jug/ml. Intenzív mosás után a megkötött fehérje mennyiségét radioaktív úton határozzuk meg. A kapott eredményeket a következő 1. táblázatban foglaljuk össze. 20 2 7. példa 25 A 26. példa szerint előállított, 131 J-HSA-tartalmú papírhordozót enzim-immuno-vizsgálathoz alkamazzuk: a sík laphordozókon az esetlegesen még szabad reakcióképes csoportokat etanol-aminnal blokkoljuk, 30 majd megfelelő hígításéi nyúl-anliluimán-albumin-antiszérummal reagáltatjuk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a nem kötött antitestek eltávolítására a papírhorodozókat háromszor mossuk, majd kecske-anti-nyúl-IgG-konjugátummal 35 (enzim: alkalikus foszfatáz) 4 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd ismételten háromszor mossuk. Az enzim-I. táblázat Megkötött131J HSA Amino-propil-trie toxi-szilán Glicid-oxi-propil-trietoxi-szilán alkalmazott fehérje-konc. 10 Mg/ml 100 Mg/ml 10 Mg/ml 100 Mg/ml FN 4 192 ng/cm3 1036 ng/cm3 75 ng/cm3 343 ng/cm3 Whatman 580 61 ng/cm3 486 ng/cm3 15 ng/cm3 76 ng/cm3 25. példa 55 A 18. példában leírtak szerint gyöngycellulózhoz humán IgG-t rögzítünk és nyúi-humán-IgG-antitest izolálására alkalmazzuk. Ehhez a hordozóval egy kromatográfiás oszlopot megtöltünk, amely humán IgG elleni specifikus antiszérumot tartalmaz. Az eluálást először PBS-pufferral, majd 3 mólos KSCN-oldattal "A végezzük. Az antitest-frakciók azonnali dialízise után a specifikus antitestek kimutatását enzim-immuno-vizsgálattal. valamint kettős radiális immun-diffúzióval (OuchU ilony-eljárás) végezzük A nem-specifi- 65 aktivitást4-nitro-fenil-foszfát-tal 0,5 ml dietanol-aminpufferban végzett hidrolízissel és a kapott enzimtermék 405 nin-en fotometriás úton való meghatározásával végezzük. 28. példa Lap alakú cellulóz hordozót (Whatman 540, Filtrak 1389, Filtrak 390, FN 3) a 22. példában leírtak szerint aktiválunk, majd két különböző koncentrációban 135J-IgG-val (alkalikus foszfatáz enzim elleni) 7
