196312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aktivált polimer-anyagú hordozó előállítására
13 196 312 14 i 11. táblázat Megkötött iiSJ-lgG Whatmann 560 Filtrak 1389 Fittrak 380 FN 3 fehérje mennyiség háromszori mosás után 10 jug/rnl 50 Atg/ml 2092 ng/cm2 5536 ng/cm2 2143 ng/cm2 6122 ng/cm2 2015 ng/cm2 5867 ng/cm2 2372 ng/cm2 5867 ng/cm2 fehérje mennyiség további 10 mosás után 10 jug/ml 50 jug/ml 1888 ng/cm2 5000 ng/cm2 1939 ng/cm2 5612 ng/cm2 1786 ng/cm2 5281 ng/cm2 2092 ng/cm2 5459 ng/cm2 fehérjemennyiség 4 hét után 10jug/ml 1913 ng/cm2 1913 ng/cm2 1786 ng/cm2 1964 ng/cm2 50/rg/ml 5l02ng/cm2 5612 ng/cm2 5306 ng/cm2 5281 ng/cm2 0,1 mólos foszfát-pufferban (6,8-es pH) inkubáljuk, majd háromszor PBS-pufferral mossuk és a rögzített Teherjc mennyiségét radioaktivitás útján határozzuk meg. Ezután a hordozókat 4 héten át többször IICI- glicin-puíTerra! (pH = 2,2), 3 mólos KSCN oldattal, karbonát/hidrogén-karbonát pufferral (pH = 10) és 20 % dioxánt tartalmazó PBS-pufferral mossuk és a fehérjetartalmat ismételten meghatározzuk. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze. 29. példa Lap alakú, papír jellegű, találmány szerinti hordozót humán 12 J-IgG-vel különböző koncentrációban és különböző puffcrck alkalmazásával 16 órán át 37 °C-on inkubálunk,majd háromszor 0,05 % Twcen-l tartalmazó PBS-pufferral mossuk (pH = 7,4) és az esetlegesen még jelenlevő reakcióképes csoportokat 1 mólos etanol-aminnat blokkoljuk, majd ismételt PBS-pufferral való mosás után a fehérjetartalmat radioaktív méréssel meghatározzuk. Az esetleges dcszorpció meghatározására a mintákat ezután hétszer ismételten PBS-pulTerral mossuk és az így nyert hordozót nyúi-anli-humáu-lgG- és alkalikus foszfatáz enzimből álló konjugátummal reagáltatjuk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután ismételten mossuk, a foszfatáz enzimaktivitását 4-nitro-fenil-foszfáttai 0,5 ml dietanol-amin-puffcrban végzett hidrolízissel, majd a kapott termék fotometráiásával vagy 1 n EDTA-val határozzuk meg. Az enzimimmuno-vizsgálat után a hordozólapokat kétszer 0,5 — 0,5 ml PBS-pufferral mossuk, majd a következő reagensekkel 1 órán át 4 °C hőmérsékleten kezeljük: 1. PBS-puffer, 2 mól NaCI és 5 % dioxán tartalommal; 2. 1 mólos KSCN; 3. 3 mólos KSCN; 4.4,5 mólos MgCÍ2; 5. 1 mólos NaJ; 6. HCl-glicht-puffer, pH = 2.8. Az összes fenti reagenssel a megkötött antigénanlltest-komplex lehasítható, így a humán-IgG-ve! reagállatotl hordozó ismélellcn az enzim-immuno vizsgálatban felhasználható. 30 30. példa Lap alakú, találmány szerinti hordozókat (F = = 56 mm2) a 22. példában leírtak szerint humán Faktor VlII-cal reagáltatunk, majd az így kapott hor- 3g dozót polisztirol-mikrotitrációs lapoknál vagy polisztircl csövekbe töltve F Vili-antigén enzim-immunovizsgálatnál alkalmazzuk (lásd W. Schössler, M. Stepanauskas, Cltr. Dittrich, H. Heine: Acta biot. med. germ. 41 /1982/ 263; VV. Schössler, M. Stepauauskas, 40 Chr. Dittrich: Acta bioi. med. germ. 41 /1982/ 695), a formatesteket a meghatározandó plazmából és feleslegben alkalmazott nyúl-anti-humán Faktor VlII-antitestoől álló keverékkel 6 órán át 37 °C-on inkubáljuk, máj 1 PBS-pufferral, amely 0,05 % Tween 20-at is tar- 45 talmaz, mossuk, majd hozzáadunk 200 p\ ürü-nyúliiiiti IgG-ből és alkalikus foszfatáz enzimből álló konjugátumol és több órán át inkubáljuk, majd a 29. pétdáb; n leírtak szerint meghatározzuk. Az antitest lchasítását a 29. példában leírtak szerint reagensekkel 50 végezzük. Az így kapott Faktor VlII-at tartalmazó hordozót további immuno-vizsgálatokhoz felhasználhatjuk. 55 31. példa A 3Ó. példa szerinti találmányban leírt hordozót monoklonális antitestek vizsgálatához alkalmazzuk. 00 A mosási műveletek elvégzése után a vizsgálandó és meghatározandó anyagot alkalmas eszközzel a hordozóra pontszerűen felvisszük. Kísérletünknél vizsgálandó anyagként megfelelően hígított nyúl-anti-humán - Faktor VIH-antiszérumot. ill. negatív kontrollként 65 antitest, forrásként nyűl-s/.érumot alkalmaztunk 8
