196312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aktivált polimer-anyagú hordozó előállítására
9 196 312 10 tett fehérje mennyiségét. Á fenti eljárás szerint a beadagolt fehérje legalább 95 %-a képes megkötődni, példánkban 186 mg IgG-ből 183 mg megkötődött, ily módon a koncentráció 36,7 mg IgG/g &cpáron. 14. példa 1 ml duzzasztott Scparont a 12. és 13. példában leírtak szerint aktiválunk, majd 3 % glutáraldehiddcl reagáltatjuk, végül 2 ml humán IgG-vel (35,5 nig/ml, 71 mg) 0,1 mólos foszfát pufferban (pH = 6,8) 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A felesleges fehérje leszívatása után a rögzített fehérje mennyiségét a 13. példában leírtak szerint meghatározzuk, ez esetünkben 23,6 mg IgG/ml Scparon. 15. példa 1 ml Scparont amino-propil-trietoxi-szilán és glicid-oxi-propil-tricloxi-szilán keverékével 2 órán át szobahőmérsékleten rázzuk, majd a felesleget leszívatjuk, a hordozót megszárítjuk és 0,1 mólos foszfát-pufferral (pH = 6,8) végül glutáraldehiddcl, majd a 14. példában leírtak szerint humán IgG-vel reagáltatjuk. A kapott hordozó 53,8 mg IgG/ml Separon koncentrációjú. 16. példa A 12. és 13. példában leírtak szerint humán IgG-t Separon-hoz rögzítünk és nyúl-antihumán-lgG-antitest izolálására alkalmazzuk. Az elválasztáshoz a fehérjét tartalmazó hordozóval a kromatográfiás oszlopot megtöltjük, amely humán IgG-elleni specif« kus antiszérumot tartalmaz, és az eluálást először PB S-pufferrel, majd 3 mólos KSCN oldattal végezzük, majd az antitest-frakciók azonnali dialízise után a specifikus antitestek kimutatását enzim-immunovizsgálattal, valamint kettős radiális immundiffúzióval (Ouchtcrlony-cljárás) végezzük. A nem-specifikus kötések vizsgálatát egy megfelelő nyúl-normál szérum felvitelével, valamint az összes antitest-tartalmú frakció poliakrilamid-diszk elektroforézisével és immunclcktroforézisével végezzük. 1 7. példa 1 g gyöngycellulózt (kizárási térfogat 5X101 * * * * 6 dalton, részecskeméret 80-200 /im, szárazanyagtartalom 64 mg/ml) 5 % amino-propil-trietoxi-szilánnal inkubálunk etanol/víz 1:1 arányú elegyében, 2,5 pll-nál 6 órán át 60 °C-on, majd kétszer 5-5 ml etanol/víz eleggyel és ötször 5-5 ml 0,1 mólos foszfát pufferre! (pH = 6,8) mossuk, majd meghatározzuk az aktiválódás mértékét, az aminocsopdrt mennyiségét a felületen (Anal. Biochem. 129, /1983/ 60). Az aktiválás mértékét az organoszilán vegyidet koncentrációjának és az inkubálási idő változtatásával széles határok között variálhatjuk. Általában 10—15 /unió! amino csoportot viszünk be 1 ml gyöngycellulózra számítva 18. példa 5 ml 17. példa szerinti gyöngyccllulózt 10 % imino-propil-lrietoxi-sziláunal inkubálunk 1: I arányú etanol/víz elegyben 60 °C-on, pH = 2,5-nél 6 órán át, majd a fenti oldószerrel kétszer, majd foszfát-pufferrel ötször mossuk (20-20 ml). Az így akti"ált hordozó-gélt ezután 5 % glutáraldehiddel reagáltatjuk 2 órán át 37 °C-on, 0,1 mólos foszíát pufferhen, majd ismételten 20-20 ml foszfát-pufferrel ötször mossuk. Ezután hozzáadjuk a 35,5 mg/ml koncentrációjú 10 ml humán IgG-oldatot 0,1 mólos foszfát-pufferban pH = 6,8-nél, szobahőmérsékleten. 2 óra elteltével a nem rögzített felesleget leszívatjuk cs a fehérje koncentrációt az 1. példában leírt módon meghatározzuk. Esetünkben a fchcrjckoncentráció 12 mg IgG/gyöngyccllutóz. 19. példa I ml gyöngycellulózt a 18. példában leírtak szerint aktiválunk cs 3 % glutáraldehiddcl reagáltatjuk, majd az így aktivált gélhez 41,3 mg/ml koncentrációban n5J-IgG-t (nyúl, alkali kus foszfatáz enzim elleni) adagolunk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A felesleg leszívatása után a hordozót 5-5 ml foszfát pufferral többször alaposan átmossuk, és a megkötött fehérje mennyiségét radioaktív mérés segítségével határozzuk meg. Értéke esetünkben 11,4 1 5 J-IgO/ml gyöngycellulóz. 20. példa 5 ml gyöngyccllulózt a 17. példában leírtak szerint 5 % glicid-oxi-propil-trietoxi-szilánnal inkubálunk 1:1 aiányú etanol/víz elegyben, pH = 2,5-nél 60 °C-on 6 órán át, majd még 120 °C-on 6 órán át melegítjük. Ezután 20-20 ml fenti oldószerrel többször, ill. 0 1 mólos foszfát pufferral alaposan átmossuk és a 18. példában leírlak szerint 35,5 mg/ml koncentrációjú 10 ml humán IgG-ycl reagáltatjuk, A fehérje koncentráció értéke 7,2 mg IgG/ml gyöngy cellulóz. 21. példa 5 ml gyöngycellulózt a 17. példában leírtak szerint 5 % merkapto-propil-trietoxi-szilánnal etanol/víz (1:1) elegyben 4 órán át 60 °C-on inkubálunk, majd kétszer 5-5 ml fenti oldószerrel és ötször 5-5 ml 0,í mólos foszfát pufferral mossuk. Az így kapott aktivált gélt 10 mg humán IgG-vel, amelyet előzőleg N-szukcinimidil-3-(2-piridil-tio)-propionátlal aktiváltunk) reagáltatunk. A felszabaduló piridin-2-tiont 343 nni-en foíometriás úton mérjük. A fentiek szerint rögzített IgG-t nyúl-antihumán-IgG-antitestek elválasztására alkalmazzuk. Az. affinitásos kromatografálás lefutása út in a diszulfid hidakon keresztül kötődő IgG-t merkapto-etanollal vagy ditio-trcilolla! (50 minél) ismét lelmsíthatjuk és az aktivált mátrixot további ligandumok megkötésére alkaisnazhatjük 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
