196312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aktivált polimer-anyagú hordozó előállítására
7 196 312 8 1 nil Sepharose 4 B®-t az 1. példában leírtak szerint aktiválunk, majd szilán vcgyülettel és glutáraldeliiddel, végül mJ-IgG-ve! reagáltatjuk a 3. példában leírtak szerint. A beadagolt ,25J-IgG koncentrációja 41,3- ing/ml. A megkötött fehérje mennyisége 5,6 mg/ml. 5. példa 6. példa 1 ml Sepharose 4 B®-t a 4. példában leírtak szerint két különböző organoszilán vegyület, majd glutáraldchiddel, végül 125J-lgG-vel reagáltatjuk. A megkötött fehérje mennyisége 15,2 mg IgG/inl gél. 7. példa A 3. és 4. példa szerint nyert 125 J-IgG-vel rcagáltatott géleket háromszor 20-20 ml 20% dioxánt tartalmazó PBS-pufferral mossuk, majd radioaktív méréssel a fehérjetartalmat meghatározzuk. A fehérje mennyisége 14,3 mg/ml értékkel változott. 8. példa Az 5. és 6. példa szerint nyert,125 J-IgG-vel reagáltatok Sepharose hordozót a 7. példában leírtak szerint mossuk. A mérések szerint a fehérjetartalom 5,6 mg/ml (5. példa), ill. 14,2 mg/ml (6. példa). 9. példa A 3—8. példában alkalmazott IgG-t nyulak alkalikus foszfatáz enzimmel való immunizálásával nyertük. Ily módon lehetséges a !25J-ígG-t a megfelelő antitest-aktivitás kihasználásával alkalikus foszfatáz enzim tisztítására és elválasztására felhasználni. Ehhez n-butanolos extrakcióval előtisztított alkalikus foszfatázt a 6. példa szerinti, ,25J-IgG-vel reagáltatok Scpharose-hoz kötünk, majd trietil-aminnal pH = = 11,4-cs értéknél cluáljuk. Az ily módon tisztított enzim aktivitása 1000 lU/mg, a kitermelés kb. 80 %, Poliakrilamidos elektroforézissel kísérő fehérje nem mutatható ki. 10. példa Az !. példában leírtak szerint humán IgG-t Trisacryl® GF 2000-hez rögzítünk és nyúl-antihumán-IgG-antitest izolálására alkalmazzuk. Úgy járunk el, hogy az IgG-t tartalmazó hordozóval egy kromatográfiás oszlopot megtöltünk, amely humán IgG elleni specifikus antiszérumot tartalmaz. Az eluációt először PBS-pufferral, majd 3 mólos KSCN oldattal végezzük. Az antitest-frakciók azonnali dialízise után a specifikus antitesteket azim-immuno-, valamint kettős radiális immun-diffúziós (Ouchterlony-cljárás) vizsgálatlal végezzük. A nem-specifikus kötések vizsgálatát a megfelelő nyúl-normál-szérum felvitele után, valamint az antitest-tartalmú frakciók vizsgálatát poliakrilamid-disk-elektroforézisscl végezzük. 11. példa 1 g Sepharose 4 B-t 5 % merkapto-propil-trimetoxi-sziiánnal (Serva, NSZK) 1:1 arányú etanol-víz elegyben 4 órán át 60 °C-on inkubálunk, majd kétszer 44 ml fenti oldószerrel és ötször 5-5 ml 0,1 mólos foszfát-púderral pH = 6,7-cs értéknél mosunk, majd a kapott gélt 10 mg humán lgG-vel reagáltatjuk, amelyet előzőleg N-szukcinimidiI-3-(2-piridil-ditio)propionáttal a gyártó előírásainak megfelelően aktiválunk (SDPD, Pharmacia). A reakció során felszabaduló piridin-2-tiont fotometriásan (343 nm) követhetjük. A fentiek szerint rögzített IgG-t a 10. példában leírtak szerint nyúl-antihumán-lgG-anlitcstck izolálására alkalmazzuk. Az affinilásos kromalográfia lefutása után a diszulfid hidakon keresztül kötött IgG-t merkapto-etanollal vagy ditiotreitollal (50inmól) ismételten lehasíthatjuk, és ily módon az aktivált mátrixot egy más ligaudum kötésére ismételten felhasználhatjuk. 12. példa 1 g 2-hidroxi-etil-metakrilát és etilén-dimetakrilát szférikus kopolimert (részecskeméret 15—25 pm, fajlagos felület 70 m2/g, kizárási térfogathatás 2X106 dalton, a továbbiakban Separon® Hema 1000) 10 % amino-propil-trietoxj-szilánnal etanol/víz (1:1) elegyben jaH = 2,5-es értéknél 60 °C-on 6 órán át, majd 120 °C-on 6 órán át inkubálunk, majd kétszer 5-5 ml fenti oldószerrel és ötször 5-5 ml foszfát-pufferral (pH = 6,8) mossuk. Az aktiválás mértékét a hordozón inért aminocsoport-tartaloinmal mérjük (G. Antoni et a!.: Anal. Biedrem. 129 /1983/ 60). Az aktiválást az organoszilán vegyület koncentrációjával és/vagy az inkubálás idejével széles határok között változtathatjuk. Általában 30 jumól/g Separon érték érhető cl. 13. példa 5 g Separon Hema 1000-et (részecskeméret 15— 25 /um) 10 % aminopropil-trictoxi-szilánnal etanol/víz elegyben (1:1) pH = 2,5-nél, 60 °C-on 6 órán át inkubálunk, majd kétszer 30-30 ml fenti oldószerrel és ötször 20-20 ml foszfát-pufferral (6,8-es pH) mossuk, majd 5 % glutáraldehiddel 2 órán át 37 °C-on 0,1 mólos foszfát-pufferban (pH = 6,8) reagáltatjuk, majd ismételten ötször 20-20 ml foszfát-pufferrei mossuk, majd hozzáadjuk a rögzíteni kívánt fehérje oldatát. Ezt követően az aktivált Scparont 10 ml, 18,6 mg/ml koncentrációjú humán IgG és 0,1 mólos foszfát-pufferben 2 órán át 37 °C-on és 4 °C-on egy éjszakán át inkubáljuk. A felesleg leszívatása után az I. példában leírtak szerint meghatározzuk a rögzí-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
