196312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aktivált polimer-anyagú hordozó előállítására
5 196 312 6 így az aktivált hordozó száraz és nedves állapotban egyaránt sokáig tárolható, és a biológiailag aktív ligandumok tartósan, extrém körülmények között is kölesben maradnak. A találmány szerinti aktivált polimer-hordozók felületén a nem-specifikus kötések kialakulása igen csekély mértékű. Az organoszilán vegyületek biokompatibilitása igen jó. A találmány szerinti hordozóként bármely ismert természetes vagy mesterséges polimer, amelynek a felületén térbelileg hozzáférhető hidroxilcsoportok vannak, felhasználható, ezek összetétele a találmány szerinti aktiválás szempontjából nem döntő jelentőségű. Előnyösen alkalmazhatók például a következő anyagok: természetes, térhálós dextrán-alapú polimerek (Sephadex®) vagy agaróz-alapú poliszaccharidok (Sepharose®) vagy cellulóz, továbbá szintetikus polimerek, így például térhálósított poli(vinil-alkoholok). di-, tri- és glicidil-mclakrilátok cs alkoholok kopolimerjei (Fractogcl®), valamint N-akiiloil-2-amino-2- hidroxi-metil-l ,3-propán-diolból levezethető kopolimerek (Trisacryl®), de természetes és mesterséges polimerek, így például agaróz és poliakrilamid kopolimerje (Ultrogel AcA®) szintén alkalmazható. Hidroxietil-metakrilát etilénglikol-dimctakrilát kopolimerek és cellulóz-tartalmú szilárd anyagok, amelyek megfelelő mennyiségű szférikusán hozzáférhető hidroxilcsoportot tartalmaznak, szintén felhasználhatók a találmány szerinti eljárásnál. A találmány szerinti eljárással aktivált hordozók általában formázott alakúak, így például lehetnek gömb-, szál- vagy szögletes alakúak, amelyeket töltéssel, szövéssel vagy kötőanyagok segítségével oszloptöltetekké, sík hordozólapokká vagy' más egyéb szerkezetekké alakíthatunk. Különösen előnyösek a gömb alakú, cellulóz-tartalmú részecskék (gyöngycellulóz), amelyeket kromatográfiás eljárásoknál és a sík, lap alakú hordozók (aktív papírok), amelyeket analitikai és diagnosztikai eljárásoknál alkalmazunk. Ez utóbbiak közé beleértjük azokat a vékony rétegeket is, amelyeket film vagy lakk formájában más, a találmány szerinti reakcióban nem résztvevő szilárd anyagok felületére viszünk fel. Ily módon a találmány szerinti hordozóanyagok homogén vagy ncm-homogén, formázott vagy nem-formázolt szerkezetűek egyaránt lehetnek. A találmány szerinti aktivált felületek alkalmasak fehérjék, antigének, antitestek, enzimek, pektinek, nukleinsavak, kis molekulatömegű ligandumok, sejtek, mikroorganizmusok és más biológiai anyagok kémiai úton való rögzítésére, és ily módon az így rögzített ligandumok felhasználhatók biospecifikus kölcsönhatásba lépő anyagok (reakciópartnerek) elválasztására és izolálására affinitásos kromatográfiánál, biológiailag fontos anyagok kvantitatív és kvalitatív kimutatására a biológiai és biotechnológiai kutatásoknál, valamint akár gyógyszerként való felhasználásra is. A következő példákkal a találmányt közelebbről illusztráljuk. 1. példa 1,0 g térhálósított dextránt (Sephadex® G 200, Pharmacia, Svédország), agarózt (Sepharose 4 B®, Pharmacia, Svédország), Trisacryl®-t (LKB, Svédország), valamint Fractogel®-t (Merck, NSZK) 5 % amino-propil-trietoxi-szilánnai (NB 1114 VEB Chemiewerk Niinchritz, NDK) 1:1 arányú etanol/víz clegyében pH = 2,5-nél 6 órán át 60 °C-on inkubálunk, majd kétszer 5-5 ml etanol/víz cleggycl és ötször 5-5 ml 0,1 mólos foszfát-pufferrel mossuk, majd az aminocsoportok meghatározásával megállapítjuk az aktiválás mértékét (G. Antoni: Anal. Biochem. 129, /1983/, 60). Az aktiválás mértékét az organoszilán vegyidet koncentrációjának és inkubálás hőmérsékletének megválasztásával széles határok közölt változtathatjuk. Jellegzetes aktiválást érhetünk el 10- 30 jumól aminocsoport/g hordozó értéknél. 2. példa 5 ml Trisacryl® GF 200-at 10 % amino-propil-lrictoxi-szilánna! etanol-víz (1:1) elegyben pH = 2,5-nel 6 órán át 60 °C-on inkubálunk, majd kétszer 30-30ml 1: 1 etanol/víz eleggyel és ötször 20-20 ml 0,1 mólos foszfát-puffcrral mossuk. pH = 6,8-ncl. Az így aktivált gélt ezután 5 % glutáraldehiddel pH - 6,8-nél 2 órán át 37 “C’-on reagállatjuk, majd ismét ötszöi 20-20 ml foszfát-pufferrel mossuk. A fehérje rögzítését egyszerűen úgy végezzük, hogy a fehérjeoldatot a fentiek szerint aktivált gélhez adagoljuk. A fenti hordozót 10 ml 35,5 g/ml koncentrációjú humán immunoglobulin G-vet 0,1 mólos foszfát-pufferben 6,8 pH értéken 2 órán át szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd a felesleget leszívatjuk. A megkötött fehérje mennyiségét az eredetileg beadagolt és a feleslegben mért fehérjeniennyiség közötti különbség adja, ami esetünkben megfelel 49,7 mg IgG/ml Trisacry'i értéknek. 3. példa 1 ml Trisacryl® GF 2000-et az 1. és 2. példában leírtak szerint aktiválunk, majd 3 % glutáraldehrddcl reagáltatjuk. A kapóit akliváll hordozót 4!,3 mg/ml koncentrációjú nyúl-125 J-IgG-vel reagáltatjuk, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A felesleges fehérje leszívatása után a kötött hordozót többször 5-5 ml foszfát-pufferral intenzíven mossuk, és a radioaktív mérés segítségévei meghatározzuk a felületen megkötött fehérje mennyiségét. Ez esetünkben 32,4 mg mJ-IgG/ml Trisacryl. 4, példa 1 ml Trisacryl® GF 2000-et amino-propil-trietoxiszilán és glicid-oxi-propil-trietoxi-szilán (Haftvermitller 6130, VEB Chemiewerk, Niinchritz, NDK) keveré kével 2 órán át szobahőmérsékleten rázzuk, majd a felesleget leszívatjuk, a visszamaradó részt szárítjuk, majd 0,1 mólos foszfát-pufferrel pH = 6,8-nél intenzíven mossuk, majd glutáraldehiddel, majd ,25J-IgG-vel a 3. példában leírtak szerint reagáltatjuk. A hordozó 32,7 mg ,ls J-IgG/ml Trisncryl-! tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
