196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával
1 196 242 2 lására, és ezt követően a fentebb leírtak szerint a DNS-t klónoztuk (Salser, W.: a következő helyen: Genetic Engineering, kiadó A. M. Chakrabarty, CRC Press, 53-81. oldal (1979)). A legalkalmasabb klónozási módszert a kérdéses mikrobától függően választjuk meg. A gazdaszervezetek és a vektorok variálhatók. Fennáll A-fág vektorként, további plazmidok, kozmidok és például Bacillus subtilis baktériumokban való klónozása alkalmazásának a lehetősége (Recombinant DNA, Benchmarck Papers in Microbiology, 15. kötet, kiadók: K. J. Denniston és L. W. Enquist; Hutchinson és Ross, Inc. (1981)); Ish- Horowicz, D. és Burke, J. F.: Nucleic Acids Res. 9, 2989 (1981)). A vizsgálat végrehajtása * A minta kezelése A vizsgálandó mikrobiális nukleinsavat a mikrobából és a fertőzött sejtekből fel keli szabadítani, és ezt követően egyszálú formává kell denaturálni. A vírus-genómák úgy szabadíthatók fel, hogy a minta anyagát 1%-os nátrium-dodecil-szulfáttal (a következőkben: SDS) kezeljük, majd a genómát védő fehéijéket proteináz-K kezeléssel elbontjuk (1 mg/ml, 37 °C, 60 percig). Ezenkívül a baktérium mintákat lizozim és etilén-diamin-tetraecetsavas (EDTA) kezeléssel le kell bontani. Ha a minta nagy mennyiségben tartalmaz viszkózus, nagy molekulasúlyú sejt-DNS-t, akkor ezt néhány helyen el kell metszeni viszkozitásának csökkentése végett, például ultrahangos kezeléssel vagy úgy, hogy a mintát néhányszor egy finom tűn átnyomjuk. A hibridizáiás végezhető például 50% -os (ionmentesített, —20°C hőmérsékleten tárolt) forma- midban, 4xSSC Denhardt-oldatíal (Denhardt, D. T.: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 23, 641 (1966)/, amely 1% SDS-t és 0,5 mg/ml DNS-t tartalmaz (borjú-thymusbó! vagy lazac spermából). A hibridizálást 37°C hőmérsékleten, általában egy éjszakán át, 16—20 órás időtartammal végezzük. A vizsgálat céljára kiválasztott szűrőket alkalmas tartóedényben inkubáljuk, ehhez hozzáadjuk a hibridizáló keveréket, és a hibridizálást megindítjuk. A hibridizáló keverékek alkotó részei a következők: (a) az előkezelt minta, amelyhez hozzáadjuk a radioaktív nukleinsavreagens(eke)t, amelyeket előzőleg 5 perces forralással és 0°C-ra való gyors lehűtéssel denaturáltunk; (b) koncentrált formamid-, SSC- és Denhardt-oldatok, amelyeket az (a) alatt leírt denaturált és lehűtött nukleinsavkeverékbe pipettázunk. összekeverés után a hibridizáló keveréket a hibridizáló edényben lévő szűrőkre pipettázzuk. Hibridizáiás után a szűrőket gondosan kimossuk, és egyenként y-számlálóban vizsgáljuk. A találmányt az alábbi gyakorlati példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Adenovirus kimutatása a sandwich hibridizálási eljárással (1. táblázat) A vizsgálati eljárás részleteit az 1. táblázathoz megadott szövegrész világítja meg, e sandwich hibridizálási eljárással kimutatható a vírus-DNS oldatban, azonban ugyanilyen megfelelően azonosítható fertőzött sejtekből származó vírus-genóma is. A háttér-hibridizálást olyan csőben mérjük, amely csak a szűrőt és a jelzett nukleinsavreagen.it tartalmazza, minta nélkül. A háttér-hibridizálást a je'zett nukleinsavreagensben jelenlevő pBR322 szekvenciák idézik élő. Ezek a szekvenciák közvetle lül hibridizálnak a szűrővel, a minta közreműködése nélkül. A vizsgálati eljárás során kontrollként boíjú-thymust tartalmazó DNS-t nem tartalmazó szűrőket használunk, ami egyrészt megmutatja a hibridizáiás specifitását, másrészt a nem-specifikus háttér-hibridizálás erősségét (amely például a ki ne m elégítő mosás következménye). Az alábbi táblázatokban a reagensek által előidézett háttér-hibridizálást a szűrőkön végbemenő hibridizáiás cpm-értékeiból levontuk. 1. Táblázat Vizsgálat adenovírusra Szörók (cpm) Minta 1) Adenonovfrus 2) Borjú-thymus u í 2. típusú adenovírus-DNS (BRL) (500 ng) 9000 49 Adenovírussal fertőzött HeLa-sejtekíóxKPsejt) 8200 — — Szűrők: í) 2 pg Ad2D—pBR322-plazmid 2) 1 pg borjú-thymus-DNS (Boehringer Mannheim) 3) Vakpróba (DNS nélkül) Jelzett nukleinsavreagens: Tisztított Ad2—BamHI C-fragmentum, fajlagos aktivitása 90 x 106 cpm/p (200 000 cpm125 J/reakció). Hibridizáiás: 50%-os formamid, 4xSSC 0,5 mg/ml lazac sperma—DNS és 1% SDS-t tartalmazó Denhardt-oldat, 37 °C, 16 óra Mosás: 0,1% SSC, szobahőmérsékleten, 40 percig Minták: 2. típusú adenovirus—DNS (BEL) A 2. típusú adenovírussal való fertőzést HeLa- 5ejteken végeztük. Ezt követően a sejteket 1% 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
