196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával
1 196 242 2 SDS-veí kezelve elroncsoltak, majd 1 mg/ml proteináz—K enzimmel (Sigma) 30 percen át 37 °C hómérsékleten emésztést végeztünk. Denaturálás előtt a mintát finom tűn vezettük át. A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értéket levontuk. 2. példa RNS-vírus kimutatása a sandwich hibridizálás segítségével (2. táblázat) Semiiki Forest vírust alkalmaztunk RNS-vírus modellként (prototípus-törzs, amelyet a Londoni Egyetem Egészségügyi és Trópusi Betegségekkel Foglalkozó Tanszékéről kaptunk), amelynek a genómája egyszálú RNS. A vírus-genómát templátként alkalmazva cDNS-t állítottunk eló, amelyet Garoff és munkatársai módszere szerint (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 6376 (1980)/ a PBR322 plazmid PstI helyére klónoztunk. Az így kapott rekombináns plazmid a pKTH312 KTL no, 232. E plazmidnak a vírus-genómából származó, beépült része körülbelül 1400 nukleotid hosszúságú, és a fehérje szerkezetének azon területéről származik, amely megközelítőleg a 200-adik nukleotídtól az 16Ó0-adik nukleotidig terjed, ha a számozást a szerkezeti gének kezdetétől végezzük (Garoff, H. és munkatársai, 1980). A reagensek elkészítése végett a teljes rekombináns pKTH312 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel (BRL) linearizáltuk (a Senliki Forst vírusból származó szekvencia nem tartalmazza az EcoRI enzim felismerésére szolgáló helyeket), és a linearizált plazmidot Xhol enzim alkalmazásával (BRL) két fragmentumra hasítotttuk. Az utóbbiak restrikciós helye a Semiiki Forest vírus szekvenciáján felül helyezkedett el. A nagyobbik EcoRI—Xhol A fragmentumot (ez körülbelül 3900 bázispárt tartalmazott) a szűrökhöz kötöttük, és a kisebbik B fragmentumot (ez körülbelül 1850 bázispárt tartalmazott) a „nick translation” (elmetszés-f átviteli) módszer felhasználásával mJ-izótoppal jeleztük. E vizsgálatunk során mind a szabad Semiiki Forest vírust, mind a vírussal fertőzött sejteket használjuk mintaként. A minta vírus-specifikus nukleinsavai mindkét esetben kizárólag RNS-ből álltak. 2. Táblázat Semiiki Forest vírus kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével Szúrók (cpm) Minta 1) Semiiki Porest vírus 2) Borjúthymus 3) Vakpróba Semiiki Forest vírus (30 pg) 3340 33 Semiiki Forest vírussal fertőzött sejtek (5 x10s) 2698 8 10 Nem fertőzött sejtek 10 5 8 Szűrők: 1) 1,2 jxg pKTH312 pkazmidból származó •iCoRI-XhoI A-fragmentum. 2) 1 pgboijú-thymus-DNS 3) vakpróba (DNS nélkül) Jelzett nukleinsavreagens: pKTH312 plazmid EcoRI—Xhol B-fragmentuma, fajlagos aktivitása 90 x 10s cpm/DNS pg/200000 cpm 125J/reakció/ Hibridizálás: Az 1. táblázathoz adott leírás szerint. Mosás: Az 1. táblázathoz adott leírás szerint. Minták: 30 pLg Semiiki Forest vírust a vizsgálat előtt SDS alkalmazásával elroncsoltunk. A fertőzött sejteket az 1. táblázatban adott leírás szerint kezeltük. A Semiiki Forest vírussal való fertőzést BHK—21 sejteken végeztük. A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értékeket levontuk. 3, példa Vírus-minta, melyben a vírus hírvivő (messenger) RNS-ét mutatjuk ki a sandwich hibridizálási eljárás segítségével (3. táblázat) A sandwich hibridizálási reagenseket SV40-VÍ- rus-DNS-ból (BRL) állítottuk elő úgy, hogy a DNS-t két részre hasítottuk PstI enzim (Boehringer Mannheim) segítségével Lebowitz és Weissman (Curr. Topics in Microbiol, Immunoi. 87, 43) leírása szerint, majd a fragmentumokat agaróz-gélen végzett elektroforézis segítségével elkülönítettük és tisztítottuk. Az A-fragmentumot (mely 4000 bázispárt tartalmazott) a mJ-izotóp alkalmazásával, „nick translation” (elmetszés+átviteli), \ módszer segítségével radioaktívan jeleztük, és a B-fragmentumot (mely 1220 bázispárt tartalmazott) kötöttünk a szűrőhöz. A DNS-fragmentumokat úgy választottuk meg, | hogy valamennyi tartalmazott mind korai, mind késői hírvivőket kódoló területeket. így például a B-fragmentum körülbelül 700, a VP1 szerkezeti fehéije-génjéből származó bázist, és több mint 600, korai hírvivők (messengerek) céljára szolgáló génből származó bázist tartalmazott. Mivel az SV40 vírust-DNS Önmagában egy kovalensen zárt gyűrű, ez linearizálás előtt vizsgálati eljárásunkkal nem volt kimutatható. Ezért amikor fertőzött sejteket használtunk mintaként, lehetővé vált annak megvizsgálása, hogy módszerünk mennyire 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 35 6
