196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával
1 196 242 2 lyek befogadták' az adenovírus-DNS fragment«* mait (Cohen, S. N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110 (1972)). A transzformált kiónok közül kiválasztottuk azokat, amelyek a legnagyobb valószínűséggel tartalmazták a rekombináns plazmidoí. Ampicillinnel és tetraciklinnel szemben rezisztenciát biztosító géneket a pH8322 plazmiddal vittünk át a baktériumra (Bolivar F. és munkatársai: Gene 2, 95 (1977)). A rekombináns plazmidot tartalmazó baktériumok azonban a tetraciklinnel szemben érzékenyek, mivel a BamHI- restrikciós hely a tetraciklin-génen belül helyezkedik el, és az e területre beépüló idegen DNS a gént tönkreteszi. Aplazmid beépülését a piazmid feldúsítása után úgy jellemeztük, hogy meghatároztuk a restrikciós fragmentumok nagyságát BarnHI emésztés után, agaróz-gélen végzett elektroforézissel. Az Adj—DNA szomszédos BarnHI D- és C-fragmentumait (vö. géntérkép) választottuk reagensekként (Söderlung, H. és munkatársai: Cell 7, 585 (1976)/. A kívánt rekombináns plazmidokat — ezek az Ad2C—pBR322, KTL No. E231 és AdD—pBR322, KTL, No. EH23Q — az irodalomban leírt módon (Clewelí D. B. ésHelinski, D. R.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 62, 1159 (1969)) tenyésztettük és tisztítottuk. Szűrón levó reagensként az AdjD—pBR322 rekombináns plazmidot használtuk. A jelenlegi alkalmazás céljára nem szükséges a plazmid-szekvenciák eltávolítása, mert a minta nem tartalmazott pBR322-szekvenciákat A radioaktív jelzés céljára azonban BamHI-emásztés után pBR322 — DNS-ből a nukleinsavat agarőz-gélen végzett elektroforézissel elválasztottuk. LGT-agarózról (Marine Colloids, Inc.) A C-fragmentumot fenollal extrahálva vagy eJektro-euálással ( Wieslander, L.: Anal, Biochem. 98, 305 (1979)) elkülönítettük, és etanolos kicsapással koncentráltuk. Különösen célszerű a jelzés céljára kiválasztott nukleinsavfragmentumnak külön vektorba való szubklónozása, hogy elkerüljük a háttér-hibridizálást, mely a jelzett nuklkeinsav reagenst szennyező, megmaradó piazmid szekvenciáknak a szűrővel végbemenő közvetlen hibridizálásából származik. Az M13 mp7 egyszálú DNS-fág (BRL), amelyre a BarnHI emésztéssel kapott DNS-fragmentumokat könnyen át tudtuk vinni, optimális vektorként alkalmazható volt (Messing, J. és munkatársai: Nukleic Acids Res. 9, 309 (1981)). A DNS megkötése a szűrön: Az Ad2D—pBR3422 rekombináns plazmidot egyszálú formává denaturáltuk, és randomizáltan több helyen elmetszettük úgy, hogy 0,2 n nátronlúggal 100°C hőmérsékleten 5 percig kezeltük; azután a DNS-t lehútöttük, közvetlenül a szűrőre való átvitel előtt közömbösítettük, és bepipettáztuk az átvivő oldatba (4xSSC közeg jégen, az SSC jelentése 9,15móS/l NaC], 0,015 mói/l nátrium-citrát). A szűrőket (Schleicher—Sebül! BA85 nitrocellulóz) alaposan átnedvesítettük a 4xSSC oldattal, körülbelül 2 órán át a DNS rávitele élőit. A DNS-t híg oldatban (0,5—1,0 pg/ml) Úgy kötöttük a szűrőre, hogy az oldatot enyhe vákuum alkalmazásával átszívattuk a szűrőn. A szűrő alkalmas volt arra, hogy körülbelül 180 fig/cm2-ig terjedő mennyiségben megkösse a DNS-t (Kafatos, F. C. és munkatársai: Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979)/. Kísérleteink során 0,5 fig DNS/2,5 cm szűróátmérő és 1,0 pg DNS/0,7 cm szűróátmérő közötti DNS- koncentrációkat alkalmaztunk. A DNS szűrése után a szűrőket 4xSSC oldatban megmostuk, szobahőmérsékleten megszárítottuk, végül 800°C hőmérsékleten 2 órán át vákuumban megszárítottuk. E kezelés után a DNS a szűrökön stabilis marad, és e szűrők szobahőmérsékleten hosszú időn át tárolhatók (Southern, E. M.: J. Mól. Bioi, 98, 503 (1975). A nukleinsavfragmmtum radioaktív jelzése Radioaktív jelzés céljából 17-J-izotópot használtunk. Ez az izotóp Y-számlálók alkalmazásával mérhető, és ezek a műszerek a legtöbb, nagyobb laboratóriumi egységben rendelkezésre állnak. Az izotóp felezési ideje 60 nap, ezért a U5J-vel jelzett reagensek körülbelül 4 hónapig használhatók. Jelzés „nick-translation” (elmetszés és átvitel) segítségével E módszer alapelve abban áll, hogy a nukleinsavban levó nukleotidok egyikét radioaktív nukleotiddal helyettesítjük, és így az egész DNS-molekula jelzetté válik. E módszert Rigby P. S. J. és munkatársai eljárása szerint (J. Mól. Bioi. 113, 237 (1977)/ alkalmaztuk. A reakció során a DNS radioaktívan jelzetté válik, ha az oldat mJ- val jelzett dezoxi-nukleozid-trifoszfátot tartalmaz szubsztrátumként — a mi esetünkben ez 125J-dCTP (Radiochemical Centre, Amersham; >1500 Ci/ rnmól). Optimális körülmények között KPcpm/ ftg—DNS specifikus aktivitást értünk el. A jelzett DNS-t a nukleotidoktól — amelyek a reakcióelegyben maradtak — egyszerű gélszűréssel, például BioGel P30 (RioRad) alkalmazásával megtisztíttottuk. Egyébb, jelzésre használt módszerek Az M13 mp7-fágban termelődött, egyszálú nukleinsavreagenst kémiai jódozássa! jelöltük: ennek során a 125J-izotóp kovalensen kötődött a nukleinsavhoz (Commenford, S. L.; Biochemistry 10,1 1993 (1971); Orosz, J, M. és Wetmur, J. G.: Biochemistry 13, 5467 (1974). A nukleinsavat egy másik módon úgy tettük radioaktívvá, hogy a terminális transzferáz enzim segítségével, radioaktív nukleotidok alkalmazásával végjelzést hajtottunk végre (Roychoudhury, R. és Wu, R.: Meth. Enzymol. 65, 43 (1980)). A reagens fentebb leírt előállítása olyan mikrobákra vonatkozik, amelyek genetikai anyaga DNS alakjában van jelen. RNS-vírusok esetében a genóma-frgmentumok klónozását úgy végeztük, hogy előbb előállítottuk a vírus-RNS DNS-másolafát (a következőkben cDNS) fordított (reverz) transzkriptáz enzim segítségével, ezután DNS-polimerázt alkalmaztunk a második DNS-szál máso-5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
