196241. lajstromszámú szabadalom • Biotechnológiai eljárás kobamid származékok előállítására
1 196241 2 1. példa a) Inokulum előállítás 10 1 hasznos térfogatú kísérleti üvegfermentorba 6 1 30 —32cC-ra előmelegített csapvizet töltünk, majd az alábbi, megfelelő előkészített (lásd alább) tápanyagokat adjuk hozzá: 35 ml metanolt, 100 ml kukoricalekvárhidrolizátumot, vagy 200 g kukoricamoslék hidrolizátumot, 30 g ammónium-hidrogén-karbonátot, 1,0 g magnézim-kloridot, 0,05 g kobalt-kloridot, 0,04 g 5-hidroxi-benzimidazolhidrokloridot és 0,30 g nátrium-biszulfitot. Az egyes komponensek beadagolása után a tápközeget alaposan összekeverjük, majd 30— 32°C-os csapvízzel 8 1-re egészítjük ki. Ezután a tápközeghez 2 1, a városi szennyvíztisztító telep anaerob utórothasztójából frissen vett, utórothasztott szennyvíziszapot adunk. Az így kapott 10 1 térfogatú tápközeget összekeverjük, az üvegfermentort gumilappal lefedjük és 32—34°C-os termosztátba helyezzük. A továbbiakban — homogenizálás után — naponta 50 ml mintát veszünk és 35 ml metanolt adunk a fermentorba, majd újabb 200 ml mintát veszünk, a fermentort gumilappal ismét lezárjuk és azonos hőmérsékleten hét napon át folytatjuk az anaerob fermentálást. Az első hét napos fermentálás után kapott fermentlé az ún. első generáció. ' A fememtálás hetedik napján ötszörös léptéknövelést hajtunk végre: egy 50 1 hasznos térfogatú fermentort 30 1 30—32°C-os csapvízzcl töltünk fel, ehhez adagoljuk az előzőekhez azonos módon előkészített tápanyagokat: 175mí metanolt, 500 ml kukoricalekvár hidrolizátumot, vagy 1000 ml kukoricamoslék hidrolizátomut, 150 g ammónium-hidrogán-karbonátot, 5 g magnézium-kloridot, 0,25 g kobalt-kloridot, 0,2 g 5-hidroxi-benzimidazol-hidrokloridotés 1,5 g nátrium-biszulfitot. A tápanyagok beadagolása után a tápközeget 30— 32°C-os csapvízzel 40 1-re egészítjük ki. Ezután a hét napos fermentlé (1. generáció) teljes mennyiségét (10 1) a frissen készített tápközeghez adjuk (átoltjuk) és intenzív homogenizálás után a fermentort lezárjuk, majd 32—34°C-os hőmérsékleten további hét napon át anaerob módon fermentáljuk. Az előzőekben leírt eljárás során kialakult az anaerob, mezofil. Metántermelő vegyes mikropopuláció, amelynek törzseit az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00076, 00079 és 000727 szám alatt deponáltunk. (Az egyes törzsek neve és jelzése a felsorolás sorrendjében: Corynebacterium sp (jelzése 24 A 1); Propionibacterim sp. (jelzése 239 Ai/6); Metanococcus sp. (jelzése MC—017). Az inokulum jellemző értékei: pH-érték 5,4—5,8 és 0,5—0,8 1 boigáz/nap/1 fermentlé. A továbbiakban az inokulum málr alkalmas III. faktor termelésre. A félfolyamatos üzemelés során naponta a fermentlé m.ntegy 10%-át feldolgozásra elvesszük és helyébe azonos térfogatú tápközeget adunk. A férfolyamatos üzemelés első napján vett mintából a 167 658 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel meghatározzuk a fermentlé hatóanyag tartalmát, amely 5,5 mg Ül. faktor/l és 0,8 mg B12 vitamin/1 összetételű. Az egyes tápanyagok előkészítését az alábbi módon végezzük: Kukoricalekvár hőkezelése (hidrolízise): a mintegy 50 t% szárazanyagtartalmú kukoricalekvárt azonos mennyiségű csapvízzel hígítjuk, majd forrásig melegítjük és 15 percig forraljuk. Forralás után az oldatot lehűtjük, majd csapvízzel az eredeti térfogatára egészítjük ki. Az így készített friss oldat az ún. hókezelt kukoricáiékvár hidrolizátum. Kukoricamoslék hókezése (hidrolízise): a 25 t% szárazanyagtartalmú kukoricamoslékot forrásig melegítjük, 60 percig forrásban tartjuk, lehűtjük szobahőmérsékletre, majd csapvízzel az eredeti térfogatára egészítjük ki. Az így készített friss oldat az ún. kukoricamoslék hidrolizátum. Az 5-hidroxi-benzimidazoI-hidrokloridot vízben feloldva adjuk a tápközeghez. A többi tápanyagot közvetlenül a tápközeghez adjuk és oldjuk fel. b) Félfolyamatos fenntartó fermentálás Az 50 I hasznos térfogatú férmentorban előállított inokulumból a félfolyamatos fenntartó fermentálás kialakítása során a fermentlé mintegy 10%-át naponta elvesszük és feldolgozzuk, helyébe azonos térfogatú, fenntartó tápközeget adunk, amelyet a következő módon készítünk: 5,0 1 30—35°C-os vízbe az alábbi tápanyagokat adagoljuk: 300 ml metanolt, 50 g kukoricalekvár hidrolizátumot, vagy 200 g kukoricamoslék hidrolizátumot, 17,5 g ammónium-hidrogén-karbonátot, 0,5 g magnézium-kloridot, 0,05 g kobalt-kloridot 0,05 g 5-hidroXi-benzimidazol-hidroklorid vizes oldatát, 0,15 g nátrium-biszulfitot. A tápközeget homogenizálás után a fermentíevet tartalmazó 50 1 hasznos térfogatú fermentorba öntjük, alapos keverés után a fermentort lezárjuk és anaerob körülmények között 32—34 °C hőmérsékleten fermentálunk. A naponta elvett 5 1 fermentlébói mintát veszünk és az a) pontban ismertetett módon meghatározzuk a hatóanyag (Bu, III. faktor és koenzim) és a metanol tartalmát, valamint a pH-értékét. A félfolyamatosítás 6—8. napján, ha a metanolízis sebessége eléri a 0,2 g metanol/1 fermentlé/óra értéket, a fent megadott tápközeghez 5 g ammónium-szulfátot és a továbbiakban 0,06 g 5-hidroxi-benzimidazoI-hidrokloridot adagolunk. A továbbiakban a 10% fermentlé elvételt és az előzőekben megadott (ammónium-szulfátot tartalmazó) fenntartó tápközeg beadagolást naponta megismételjük. Dymódon azrinokulum fermentáció fokozatosan fenntartó fermentációvá alakult át, amelynek hatóanyagtartalma 14 mg ül. faktor/l és 2,5 mg B,2 vitamin/1. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
