196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 (S’, példa A pEL!07, pEL/05, pEL108 éspELI04 jelű plazmidok előállítása 5 A) A pLR2 plazmid emésztése BamHI enzimmel és az 1,6 kb nagyságú tiostrepton-rezisz.tenciát meghatározó fragmens izolálása 50 (.ig pLR2 plazinid dezoxiribonukleinsavat, 10 10 [il reakcióelcgyet (lásd előbb). 10 (i! marhaszcrum-albumint (1 mg/ml koncentrációjú), 29 (d vizet és 1 (d (4 egység/(d) BamHI restrikciós enzimet keverünk, a reakcióelcgyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten emésztjük. Azonos térfogatú 4 mólos 15 ammónium-acetát-oldatot és 2,5 térfogat 95%-os etanolt adunk az elegyhez, majd 18 órán át a dezoxiribonukleinsav kicsapására — 2U°C hőmérsékleten tartjuk. A dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálássa! összegyűjtjük és 50 pl TE-puf- 20 ferban szuszpendáljuk. Az előállítani kívánt 1,6 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst ismert módon izoláljuk a dezoxiribonukleinsav-szuszpenzióból, az izolálást gél elektroíorézissel végezzük. Az izolálást követően a fragmenst 20 pl TE-pufferban 25 szuszpendáljuk a következő ligádéhoz. B) A pEL103 plazmid emésztése BamHI enzimmel 20 pg pEL103 plazmid dezoxiribonukleinsaval, 30 10 (il reakcióelegyet, 10 pl, 10 mg/ml töménységű marhaszérum-albumint, 39 pl vizet és l pl BamHI restrikciós enzimet (2 pl enzim és 8 pl víz elegyítésével állítjuk elő) elegyítünk, az elegyet 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Azonos térfoga- 35 tú 4 mólos ammónium-acetát-oldatot és 5 térfogatnyi, 95%-os etanolt adunk a reakcióelegyhez. majd a dezoxiribonukleinsav kicsapására 18 órán át — 20 °C hőmérsékleten tartjuk. A dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálássa! összegyűjt- 40 jük, 70%-osetanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután 50 pl TE-pufferban szuszpendáljuk. tünk, a reakcióelcgyet 4 órán át 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 40 pl 4 mólos ammóniumacetát oldatot és 200 pl hideg etanolt adunk az elegyhez, majd a dezoxiribonukleinsav kicsapásá- 55 ra 18 órán át —2()°C hőmérsékleten tartjuk. A dezoxiribonukleinsav csapadékot ccntrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, ismét összegyűjtjük, majd ezután 50 pl P-óldatban (lásd: Hopwood és Wright, J. Molecular and General qq Genetics, 162, 307, 1978.) szuszpendáljuk transzformálásra. Legalább két típusú rekombináns plazmidot kapunk, attól függően, hogy a pEL103 restrikciós fragmensei hogyan kapcsolódnak a BamHI 1,6 kb 65 nagyságú tiostrepton rezisztenciát hordozó fragmenshez. így, a 2,8 kb nagyságú BamHI restrikC) Ligálás f P.EL103 dezoxiribonukicinsav íészíeg ni R2ébi° kap1?“,^18yet’ 10 Hő 1.6 kb nagys gu, pLR2 plazmidbol kihasított BamHI restrikció fagmenst, 5 pl ligációs elegyet (lásd előbb) 5 1 mg/ml töménységű marnászeruni-aiuinmm'V' vizet cs 1 pl T4 dczoxiribonukleinsav-ligázt c!cg\ ciós pEL103 fragmenshez való kapcsolódáskor a 4,4 kb nagyságú pEL107 és pEL105 plazmidokat kapjuk meg, a 19,9 kb nagyságú BamHI fragmenshez (a linearizált pEL103) való kötődéskor a 21,5 kb nagyságú pELlOB és pEL104 plazmidokat kapjuk. A [iEL 108 és pEL104 beépülés! izomer plazmid jait is megkapjuk, mivel a pEL103 plazmidnak három BamHI restrikciós helye van, ahová a tiostrepton rezisztenciát meghatározó fragmens beépülhet. A rekombináns plazmidok két orientációban léteznek, mivel az 1,6 kb nagyságú BamHI rezisztenciát meghatározó fragmensek mindkét irányban beépülhetnek. A pEL107 és pEL105 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét az 5., a pEL!08 és pEL104 plazmidokét pedig a 6. ábrán mutatjuk be. A témában jártas szakemberek felismerik és megértik, hogy a pEL103 plazmid BamHI enzimmel való részi, ges emésztésekor a különböző restrikciós fragmensek keveréke keletkezik, ezek egymással és egy vagy több rezisztenciát meghatározó dczoxiribonukleinsav-fragmenssel kapcsolódhatnak, ily módon több rekombináns plazmid jön létre. Bármely olyan plazmid, amely tartalmazza a 2,8 kb nagyságú BamHI repiikációs origint hordozó fragmenst, funkcionális (működik), és így a találmány oltalmi köréhez tartozik. Az előzőekben ismertetett plazmidok ismert módon transzformálhatok megfelelő gazdasejtekbe, és ezt követően pedig restrikciós enzimmel és gél elektroforetikus analízissel azonosíthatók. 9. példa A Strepiomyces ambofacienstpEL.107, S. ambofaciens/pELlflS, S. ambofaáens/pELlOS és a S. amho fadens/pEL104 előállítása Az előállításhoz 20 (ig. a 8C, példában megadottak szerint előállított dezoxiribonukleinsavat és egyszer HL Streptomyccs ambofaciens protoplasztol használunk. A törzset letétbe helyeztük a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjieményében, ahonnan NRRL 2420. szám alatt megrendelhető. A transzformációt lényegében az International Publication of International Patent Application No. PCT/GB79/ 00095, No. W079/01169 2. példája alapján végeztük. A transzformánsokat tiostrepton rezisztenciára szelektáltuk oly módon, hogy a regenerálódó R2-táptalajon (Hopwood és Wright, Molecular and General Genetics, 162, 30, 1978.) megfelelő tiostrepton mennyiséget tartalmazó réteggel felülretegeztük oly módon, hogy az antibiotikum koncentrációja a táptalajban 50 gg/tnl legyen. A kapott Streptomyccs ambofaciens/pEL107, S. ambofaeiens/pELl05, S. ambofaciens/pELlG8 és S. ambofaciens/104 tiostreptonra rezisztens telepeket izoláljuk, ismert módszer szerint. Az izolált törzseket tenyésztjük, és a konstitutív plazmidokat restrikciós enzim cs elektroforetikus analízissel azonosítjuk. 10. példa A pELI06, pELI 10, pELlll éspELU2 plazmidok előállítása A) A pl.Rí plazmid emésztése BamHI enzitn-9
