196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 inéi, és a 3,4 kb. nagyságú, neonácin rezisztenciái meghatározó fragmens izolálása. Az emésztést és az izolálást a 8A. példában megadottak szerint végezzük. A 3,4 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst 20 pl TE-pufferban szuszpendáljuk a következő ligációs reakcióhoz. B) Ligálás A 3,4 kb nagyságú BamHI neomicin rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmenst hozzákapcsoljuk a pEL103 plazmid BamHI részlegesen emésztett fragmenseihez (ezeket a 8B. példában megadottak szerint állítjuk elő), a ligálást a <SC. példában megadottak szerint végezzük. Legalább két típusú rekombináns plazmidot kapunk, attól függően, hogy a pEL103 restrikciós fragmensek hogyan kapcsolódnak a 3,4 kb nagyságú BamHI neomicin rezisztenciát meghatározó fragmenshez. így, ha a 2,8 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst (a pELI03-ből) használva megkapjuk a 6,2 kb nagyságú pEL109 és pELllO plazmidokat, a 19,9 kb nagyságú pEL103 BamHI fragmens (linearizált pEL103) használatakor pedig a 23,3 kb nagyságú pELlll és pELl 13 plazmidokhoz jutunk. Létrejönnek ezenkívül a pEL 111 és pELl 12 plazmidok Leépülési izomerjei is, mivel a pEL103 plazmidnak három BamHI restrikciós helye van, ahová a neomicin rezisztenciát meghatározó fragmens beépülhet. A kísérlet során ugyanakkor létrejön a rekombináns plazmidok két orientációjú alakja, mivel a 3,4 kb nagyságú BamHI rezisztenciát meghatározó fragmens mindkét irányban beépülhet. A pEL109 és pELllO plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképet a 7., a pELlll és pEL112 plazmidokét pedig a 8. mellékelt ábrán adjuk meg. A témában jártas szakember felismeri és megérti, hogy a 8C. példában megadottakhoz hasonlóan további rekombináns plazmidok jönnek létre, amelyek tartalmazzák a 2,8 kb nagyságú BamHI enzimes emésztéssel kapott és replikációs originl tartalmazó fragmenst. Ezek a plazmidok funkcionálisak, és így tovább példázzák a találmány szerinti eljárást. A fenti plazmidok ismert módon transzformálhatok, és restrikciós enzimes és géb elektroforetikus analízissel azonosíthatók. /1. példa A Streptomyces am bofaciens/p E L109, S. ambofaciens/pELI 10, S. ambofacicnslpEI.IlI es a S. ambofaciens/pELI 12 előállítása 20 pg, a 10. példában megadottak szerint előállított dezoxiribonukleinsavval I x Kb Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) protoplasztot transzformálunk. A kísérletet lényegesen az International Publication (of International Patent Application PCT/GB79/00095) W079/01169 2. példája szerint végezzük. A transzfoimánsokat neomicin-rczisztenciára szelektáljuk, oly módon, hogy az R2 táptalajon regenerálódó protoplasztokut olyan ugarral rétegezzük fel, amelyek annyi neomicint tartalmaznak, hogy a lemezen a végkoncentráeió 1 pg/ml legyen. A kapott Streptomyces ambofacicns/pEL 109, S ambofaciens/pELI 10, S. ambofacicns/pEL! 11 és S. ambofaciens/pELI 12 ncomicinre rezisztens telepeket ismert módon izoláljuk, és ezután restrikciós enzimes és elektroforetikus analízissel azono-i sítjuk a konstitutív plazmidokat. A neomicin antibiotikumot az alábbi helyen szereztük be: Sigma. St. Louis, Missouri. 12. példa A pELl13 és pELl 14 plazmidok előállítása A pEL107 plazmidot a Streptomyces ambofaciens/pEL107, a 9. példában megadottak szerint előál'ított törzsből izoláljuk, az 1. példában megadottak szerint eljárva, majd a 8B. példában megadottak szerint részlegesen emésztjük BamHI restrikciós enzimmel. A részleges BamHI emésztést követően a SC\ példában megadottak szerint ligáinak a 10A. példában megadottak szerint a pLRl plazmidból előállított, 3,4 kb nagyságú, neomicin rezisztenciát meghatározó BamHI fragmenshez. A kísérlet során megkapjuk a pEL113 és pEL114 plazmidok bcépfilcsi izomerjeit is, mivel a pELl07 plazmid két BamHI restrikciós hellyel rendelkezik, ahova a neomicin rezisztenciát meghatározó fragmens beépülhet. Ugyanakkor két orientációjú1 rekombináns plazmidot kapunk, mivel a 3,4 kb. nagyságú BamHI neomicin rezisztenciát hordozó, fragmens két irányban orientálódhat. A pEL113| plazmid restrikciós helyeit és funkcionális térképét a pELU4 plazmiddal együtt a 9. mellékelt ábrán adjuk meg. 13. példa A Streptomyces ambofaciens/pELI 13 és S. ambofaciens/pELI14 előállítása 20 pg, a 12. példában megadottak szerint előállított dezoxiribonukleinsavval lxlO8 Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) protoplasztot transzformálunk. A kísérletet lényegében az International Publication (of International Patent Application PCT/GB79/00095) W079/01169 második példáj; szerint végezzük. A transzformánsokat először tiosirepton rezisztenciára szelektáljuk, majd a 9. és ! I. példában megadottak szerint neomicin rezisztenciára. A kapott Streptomyces ambofaciens/ pEL113 és S. ambofacicns/pEL 114 tiostreptonra és ncomicinre rezisztens telepeit izoláljuk, ismert módszerek szerint, és ezután restrikciós enzimes és eícktroforézises analízissel azonosítjuk a konstitutív plazmidokat. 14. példa A pEl.l 15 és pELl ló plazmidok előállítása A plazmidokat a 12. példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy á pEL107 plazmid helyett pEL105 plazmidot használunk a BamHI emésztés során. Létrejön a pELl 15 és pELl 16 plazmidok beépülési izomerjeinek sora is, mivel a pEL105 plazmid két BamHI restrikciós helyet tartalmaz, ahova a neomicin rezisztenciát meghatározó fragmens beépülhet. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 65 60 65 10
