196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 1962 39 2 majd ezt követően transzformálásra 50 pl P-oldatban szuszpendáljuk. A pFJ146 plazmid restrikciós helyeinek térképét a mellékelt 15. ábrán adjuk meg. 26. példa A Streptomyccs ambofaciens!'pFJ146 előállítása A kísérletet a 11. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 10. példa szerinti dezoxiribonukleinsav helyett a pFJ146 piazmidot használjuk. 27. példa A pFJ 146 plazmid előállítása A) Az E. coli 803/pI)143 tenyésztése és a pIJ43 plazmid izolálása Az E. coli 803/pIJ43 (ATCC 39156) tenyésztését és a pIJ43 plazmid ezt követő izolálását Davis és munkatársai szerint végezzük [A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980)]. A plJ43 dezoxiribonukleinsavat TE-pufferban szuszpendáljuk és -2.0 °C hőmérsékleten tároljuk. B) A pIJ43 plazmid 2,7 kb nagyságú Sail—Bglll fragmenségek emésztése és izolálása Az emésztést a 21. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pELH)5 plazmid, a BamHl restrikciós enzim és reakcióclegy, a Bell restrikciós enzim és reakcióclegy helyett a plJ43 piazmidot, a Sail restrikciós enzimet és az alábbiakban ismét tetett reakcióelcgyet. továbbá a Bglll restrikciós enzimet és a hozzá tartozó reakcióelcgyet (lásd alább) használjuk. A Sáli enzimmel végzett emésztés részleges. A kapott Sáli —- Bglll fragmenseket elkülönítjük és ismert módon agaróz gélelektroforézissel [Davis és munkatársai (1980), lásd fent] izoláljuk. A Sail restrikciós enzimhez használt reakcióéi egy összetétele a következő: 1,5 mól nátriurh-klorid 60 rnmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9 60 mmói magnézium-klorid 60 mmó! ß-merkapto-etanol l mg/ml mariiaszérum albumin. A Bglíl restrikciós enzim használatakor az alábbi összetételű reakcióelcgyet adagoljuk: 0,6 mól nátrium-klorid 100 mmói trisz-hidrogénklorid, pH=7,4 1(H) mmói magnézium-klorid 1(H) mmó! ß-mcrkapto-etanol 1 mg/né marhaszérum albumin. C) A pFJ124plazmid emésztése Bambi.I és részleges emésztése Sáli enzimmel 20 pg pFJ124 dezoxiribonukleinsavat, 10 pl, 1 mg/ml töménységű marha szérum albumint, 39 [d vizet, 1 pl BamHl restrikciós enzimet (fölös mennyiségű New England Bio Láb. egységet tartalmaz) és 10 pl reakcióelcgyet inkubálunk 37°C hőmérsékleten 60 percen át. Ezután 10 percen át 65 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást, 4 °C-ra hűtjük az elegye), és 10 pl Sáli rekciöeleggyel és 1 pl Sail restrikciós enzimmel egészítjük ki. 60 percen át 37 DC hőmérsékleten inkubálunk. Ezután azonos mennyiségű 4 mólos ammónium-acetát-oldatot és 2 térfogatnyi 95%-os etanolt adunk az clcgyhcz, majd 18 órán át -20°C hőmérsékleten tartjuk, a dezoxiribonukleinsav kicsapására. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%os etánoilal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, majd ezt követően 50 pl TE-pufferban szuszpendáljuk. D) Ligálás A niJ43 plazmid 2,7 kb nagyságú Sáli—Bglll fragmenst hozzákötjük a pFJ124 plazmid BamHI- részleges Sáli emésztett fragmenséhez, a kötési reakciót a 8C. példában megadottak szerint végezzük. A kapoF dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, ismét összegyűjtjük, és ezután 50 pl P-oldatban szuszpendáljuk, transzformálásra. A pFJ 147 plazmid restrikciós helyeinek térképét a mellékelt 15. ábrán adjuk meg. 28. példa A Streptomyccs atnhofacienslpF.il47 előállítása Az előállítást a 9. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 8C. példában megadottak szerint előállított dezoxiribonukieinsav helyett a 27. példában megadottak alapján előállított pFJ147 piazmidot használjuk. A kapott transzfőrmánsokat eritromicin rezisztenciára szelektáljuk oly módon, hogy a regenerálódó protoplaszlokat R2 agarral rétegezzük fölül, az agar annyi eritromicint tartalmaz, hogy a lemezben lévő táptalajban koncentrációja 50 pg/ml legyen. A kapott eritromicin rezisztens telepeket tiostrepton rezisztenciára szelektáljuk, és így izoláljuk a Streptomyccs ambofaciens/pFJ 147 transzformánsokat. A transzfőrmánsokat plazmid restrikciós enzimes és géleiektroforetikus analízisével tovább azonosítjuk. 29. példa A pF.Jl48 éspFJ149plazmídok előállítása A) A pl.I43 plazmid részleges emésztése Sáli enzimmel. Az emésztést a 6. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pLRl plazmid és a BamHl restrikciós enzim és a hozzá tartozó reakcióclegy helyett a plJ43 piazmidot, illetve a Sáli restrikciós enzimet és a hozzá tartozó reakcióeiegyet használjuk. A részleges emésztés után kapott Sáli fragmenseket elkülönítjük és agaróz gélelektroforézissel ismert módon izoláljuk A Sál! fragmcns2,8 kb. nagyságú. B) A pFJJ24 plazmid részleges emésztése Sáli enzimmel. Az emésztést a 6. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pFJ124 piazmidot és a Sáli restrikciós enzimet és a hozzá tartozó reakcióelcgyet használjuk a pLRl plazmid P. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
