196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 és á BamHI restrikciós enzim és a hozzá tartozó reakcióelegy helett. A kapott dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és ezután 50 pl TE-pufíerban szuszpcndáljuk. C) Ligái ás A pIJ 143 plazmid 2,8 kb nagyságú Sail fragmensét hozzákötjük a pFJ124 plazmid részleges Sáli enzimes emésztésével kapott fragmcnséhez. a kötési reakciót a 8C. példában megadottak szerint végezzük. A kapott dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, ismét összegyűjtjük, és ezután 50 pl P-oldatban szuszpcndáljuk, a transzformálás céljára. A kísérlet során két orientációjú rekombináns plazmidot kapunk, mivel a 2,8 kb nagyságú Sáli fragmens mindkét irányban beépül. A pF.1148 és pFJ149 plazmidokat a megfelelő gazdasejtekbe transzformálhatjuk, és ezután restrikciós enzimes és géiclektroforctikus analízissel azonosíthatjuk azokat. 30. példa A Streptomyccs ambofacienslp FJ14H és a S. ambofacienslp FJ 149 előállítása Az előállítást a 9. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 8C. példában megadottak szerint előállított dezoxiribonukleinsav helyett a 29C. példában előállított terméket használjuk. A transzformánsokat critromicin rezisztenciára szelektáljuk oly módon, hogy a regenerálódó protoplasztokat annyi eritromicint tartalmazó R2 agarral rétegezzük felül, hogy a Petri-csészében lévő táptalaj ml-ében 50 pg eritromicin legyen. A kapott Streptomyces ambofaciens/ pFJ148. és S. ambofac;ens/pFJÍ49, eritromicinre rezisztens telepeket ismert módon izoláljuk, tenyésztjük és tiostreptoi rezisztenciára vizsgáljuk. A konstitutív plazmidokat restrikciós enzimes és gélelektroforézises analízissel azonosítjuk. A transzformánsokat ismert módon tenyésztjük a pFJ 148 és pFJ 149 plazmidok előállítására és izolálására. A pFJ148 és pFJ149 plazmidok restrikciós helyeinek térképét a mellékelt 16. ábrán adjuk meg. 31. példa A pFJ150és pFJ151 plazmid előállítása A) ApBR322 és pFJ147 plazmid emésztése BamHI enzimmel Az emésztés a 2B. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a HiudlII restrikciós enzim és a hozzá tartozó reakcióelegy helyett a BamHI restrikciós enzimet és a hozzá tartozó reakcióclegyct használjuk. i B) Ligálás A pBR322 és a pFJ147 plazmid BamHI enzimmel emésztett fragmenseinek ligálását a 8C. példában megadottak szerint végezzük. Az előállított kimer plazmid dezoxiribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután 50 pl TE-pifferban szuszpendáljuk. Két orientációjú rekombináns plazmidot kapunk, mivel a pBR322 plazmid mindkét irányban beépülhet. A pFJ150és pFJ 15 L plazmiddal megfelelő gazdasejteket ismert módon transzformálhatunk, és ezután a plazmidokat restrikciós enzimes és gélelektroforézises analízissé1 azonosítjuk. 32. példa Az F. coli ki2 HB!01/pFJ150 és a E. coli KI2 11B101 IpFl 131 előállítása Az előállítást a 19. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pEL121 és, pEL122 plazmidok helyett a pFJ150 és pFJ15l| plazmidokat használjuk. A túlélő telepeket először, a várt fenotípusra (Ampicillin rezisztencia és tetra-j ciklin szenzitivitás) vizsgáljuk, és ezután restrik-| ciós enzimes és elektroforetikus analízissel azonosít-juk azE. coli K12HB101/pFJ150ésE. coliK12 HB101/pFJ151 transzformánsokban lévő konstitutív plazmidokat. A pFJ150 és pFJ151 plazmidok restrikciós helyeinek térképét a mellékelt 16. ábrán adjuk meg. 33. példa A Sterptomyces ambofaciens/pFJl50 előállítása , Az előállítást a 9. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 8C. példa-, ban megadottak szerint előállított dezoxiribonukleinsav helyett az E. coli K12 HB101/pFJl50 törzsi ől előállított pFJ 150 plazmidot használjuk. 34. példa A Sí eptomyces ambofaciensIpFJlS 1 előállítása Az előállítást a 9. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 8C. példa szerinti dezoxiribonukleinsav helyett a 32. példa szerint előállított E. coli K12 HB101/pFJÍ51 törzsből izolált pFJ 151 plazmidot használjuk. Az előzőekben ismertetett reprezentatívplazmi-, dóka? és transzformánsokat az I. és a II. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
