196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
t 196236 2 tek pl. elektroforézissel történő elválasztása szükséges, mert ezeknek az enzimeknek a felismerő helyei a prekurzor szekvencián belül is előfordulnak, (az 1091. nukleotidnál az Alu I esetében és az 1428. nukleotidnál a Him II esetében). A találmány szerint előállított mikroorganizmusokat a Culture Collection of tire National Collection oflndustrial Bacteria, Aberdeen, Skócia deponáló helyen 1979. december 19-én letétbe helyezett tenyészetek példáival támasztjuk alá és pBR322—HBV—G-től L-ig terjedő számokban azonosítjuk. A mikroorganizmusokat az alábbiakban jellemezzük: G: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG: HB W-Kpn I dC: (továbbiakban „pHBV 114”): TetK Amps HBV+ H: E. coli HB 101/pBR322-Pst I' dG: pHBV 114-PsrIdC: I: TetR Amp5 HBV+ VA+ I: E. coli HB 10I/pBR322-£co Rí. Bam Hl: lac promoter szekvenciaj-Hí/id III kapcsolók: HBV WA-Hha I Bam HI: Tets AmpR HBV1 VA+ J: E. coli HB 101/pUR2 *Eco RI: HBV 114-Hha I Eco Rí kapcsolók: Tets AmpR HBV1 VA1 K: E. coli HB i01/pBR322-Ps/ I dG: pHBV 144-Ava I dC: TetR Amps HBV+ VA + L: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG: pHBV 144-Tbc/ dC: TetR Amps HBV VA1 A példa Ebben a példában leírunk a hepatitisz B belső antigének („HBcAg”) fajlagosságával rendelkező polipeptidek előállítására szolgáló eljárást, amely abból áll, hogy ezt a polipeptidet kódoló DNS fragmenst beiktatjuk egy Bacillus klónozó vektorba, és egy Bacillus gazdaszervezetet transzformálunk egy ilyen vektorral, hogy replikálódjék és kifejezze a beiktatott DNS fragmenst, és termelje a HBcAg polipeptidet. Megfelelő klónozó vektort alkotunk meg pBR322 E. coli plazmidot [F. Bolivar és munkatársai: „Construction And Characterization of New Cloning Vehicles II. A. Multi-Purpose Cloning System” (Új klónozó közelítők megalkotása és jellemzése II. Egy több célú klónozó rendszer), Gene, 95-113 (1977); J. G. Sutcliffe. „pBR322 Restriction Map Derived From the DNS Sequence: Accurate DNS Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long” (A pBR322 DNS szekvenciából származó restrikciós térképe: pontos DNS méret jellemzők 4361 nukleotid-pár hosszúságig), Nucleic Acids Research 5, 2721-28 (1978); J. G. Sutcliffe: „Complete Nucleotide Sequence Of The Escherichia coli Plasmid pBR322” (A pBR322 Escherichia coli plazmid teljes nukleotid szekvenciája), Cold Spring Harbor Sympozium 43 I. 77— 90 (1978)] kombinálva pBD9 plazmiddal, azzal a plazmiddal, amelyről ismert, hogy replikálódik Bacillus gazdaszervezetben [„Construction And Properties of Chimeric Plasmids In Bacillus Subti-* A tetraeiklin rezisztenciát kódoló gént tartalmazó DNS szekvencia helyett E. coli lac rendszert tartalmazó kisebb DNS szekvenciájú pBR322 származék. lis”(Kíméraplazmidok megalkotása és tulajdonságai Bacillus subtilisben, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1423 — 28 (1978); „Characterization Of Chimeric Plasmid Cloning Vehicles In Bacillus Subtilis” (Kiméra plazmid klónozó közvetítő jellemzése Bacillus subtilisben), J. Bacteriol. 141, 246-53(1980)|. A két plazmid ligálását olyan módon hajtjuk végre, hogy mindkét plazmidot Eco Rí restrikciós endonukleázzal hasítjuk el, és a két linearizált plazmidot egyesítjük T4 DNS ligáz jelenlétében. Mivel a pBR322 hordozza a penicillin rezisztenciát (AmpR) és tetraeiklin rezisztenciát (TetR) kódoló géneket, és a pBD9 hordozza a kanamicin rezisztenciát (Km11) és eritromicin rezisztenciát (EmR)* kódoló géneket, és ezeknek a géneknek egyik sem inaktiválódik a két plazmid fúziója során, a kombinált plazmid, amelyet pKH80-nak nevezünk, hordozza mind ü négy rezisztencia markert. (*Az eritromicin rezisztenciát egy mintegy 29000 móltömegű polipeptid viszi át. A polipeptid előállítását az eritromicinnek inhibitor-szint alatti koncentrációi indukálják). Mivel a pKH80 plazmid E. coli plazmid és Bacillus plazmid kombinációja, ezeknek a törzseknek mindegyike alkalmazható gazdaszervezetként a plazmidhoz. Mivel az E. coli gazdaszervezet transzformálása valamivel könynyebb, mint a Bacillus gazdaszervezet transzformálása, és különösen mivel a transzformálás gyakorisága általában nagyobb E. coli gazdaszervezetben, mint Bacillus gazdaszervezetben, előnyös kezdetben E. coli gazdaszervezetet transzformálni a fentebb megalkotott plazmiddal és kiválasztani a korrektül megalkotott plazmidokat ebben a gazdaszervezetben. Ezeket a plazmidokat lehet azután alkalmazni a kívánt Bacillus gazdaszervezet transzformálására. A korrektül megalkotott plazmidokat olyan módon választjuk ki, hogy E. coli HBlOÍ-et transzformálunk a fenti plazmidokkal és kiválasztjuk ampicillinre (40 pg/ml), tetraciklinre (25 pg/ml) és kanamicinre (5 pg/ml) való rezisztenciájuk alapján L-agar lemezeken. A pBR322 és pBD9 relatív orientációját pKH80-ban Ps7l-gyel végzett emésztéssel határozzuk meg, mivel a pKH80 két PaíI helye aszimmetrikus a pKH80 pBD9 és pBR322 részei szempontjából. A pKH80 eritromicin rezisztenciát is ad át E. coli HB101 gazdaszervezetnek, amelyet ezzel transzformáltak. Ezen kívül az eritromicin rezisztencia gén által kódolt 29000 móltömegű fehérje is kimutatható pKH80-mal transzformáit és 2 pg/ml enitromicinnel indukált E. coli minisejtekben. A HBcAg antigenicitását mutató polipeptidet kódoló DNS fragment kiválasztjuk és beiktatjuk a klónozó vektorba és Bacillus gazdaszervezetet transzformálunk a rekombináns DNS molekulával, hogy a HBcAg antigenicitását mutató polipeptideket állítsunk elő. Egy, a jelen találmány szerinti megfelelő rekombináns DNS molekulát emésztünk Ps/I-gyel, hogy kihasítsunk egy HBcAg-val rokon DNS fragmenst tartalmazó DNS szekvenciát. A kimetszett fragmenst standard körülmények között BAL—31 exonukleázzal kezeljük úgy, hogy egy átlag 100 bázispáros darabot távolítunk el a DNS szekvencia mindegyik vegéből. BamHl és Hindii linkerek 5 :5 20 25 3D 35 40 45 50 55 60 65 13
