196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196236 2 (kapcsolók) keverékét ligáljuk azután az emésztett fragmens végeihez. BamHl emésztés után a íragmenst beiktatjuk a pBR322 BamHl helyébe. E. coli HBÍOl-et transzformálunk ezekkel a hibrid plazmidokkal, és azokat a gazdaszervezeteket, amelyek rezisztensek ampicillinre (40 pg/ml) és érzékenyek tetraciklinre (15 jxg/ml)^ kiválasztjuk. (*A BAmlll hely a pBR322-ben a tetraciklin rezisztencia kódoló génben helyezkedik el. Ezért egy DNS fragmens beiktatása annál a helynél inaktiválja a tetraciklin rezisztenciát kódoló gént, és a gazdaszervezetet, amelyet az így létrejött rekombináns DNS molekulával transzformáltunk, érzékennyé teszi tetraciklinre). A kiválasztott transzformált gazdaszervezetekből a plazmid DNS-t hagyományos módon izoláljuk, és a nukleotid szekvenciát a pBR322 és a beiktatott HBcAg kódoló fragmens 5' vége közti elágazásnál meghatározzuk A. M. Maxam és W. Gilbert módszere szerint [„A New Method For Sequencing DNA” (ÚJ módszer a DNS szekvenciaelemzéshez). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 60 - 64(1977)]. Az izolált plazmidok egyikének (pH 98) nuklcotid szekvenciája azeritromicin rezisztenciát kódoló gén ismert szekvenciájával együtt, és a Bell hely elhelyezkedése ebben a génben megengedi azt az előrejelzést, hogy a HBcAg —BamHl fragmenst be lehet iktatni az eritromicin rezisztenciát kódoló gén Bell helyébe a pKH8ü-ban, megfelelő leolvasó keretben, olyan módon, hogy a befejező kodon, amely három nukleotidda! előzi meg a HBcAg-rokon DNS fragmens AUG start kodonját a pH98- ból származó BamHl fragmensben, fázisban legyen az eritromicin rezisztenciát kódoló génnel a pKH80-ban. Ezért elvárható, hogy ezekben a kosírukciókban az eritromicin gén kifejeződése szokásos start kodonjánál kezdődjék és a HBcAg beiktatott rész által nyújtott stop kodonnái fejeződjék be. De novo kifejeződés kezdődhet ekkor ismét a HBcAg-rokon DNS fragmens AUG staríkodonjánál, egy nem fuzionált terméket állítva elő, amely a HBcAg antigenicitását mutatja. Következésképpen a pH98 BamHl fragmensét beiktatjuk a pKH80 Bdl helyébe* (*A BamHI-vel és Bel 1-vel végzett emésztéssel termelt DNS fragmenseknek GATC szekvenciájuk van 5' végüknél úgy, hogy egy olyan fragmenst, amelyet BAmHI- vef végzett emésztéssel állítunk elő, be lehet iktatni egy Bell helybe). Amint korábban, korrektül konstruált rekombinált DNS molekulákat választunk ki E. coli HB101-be való transzformálás után [itt ampicillinre (40 pg/ml) és tetraciklinre (25 pg/ ml) való rezisztencia és aritromicinre (60 pmi) való érzékenység alapján]. Az antibiotikum érzékenységnek és rezisztenciának ez a kombinációja azt jelzi, hogy az E. coli gazdaszervezet olyan plazmiddal van transzformálva, amely rezisztenciát hordoz tetraciklinre és ampicillinre, és nem hordoz rezisztenciát eritromicinre (azaz a hibridmolekula pKHSO-ból származik, de az eritromicin rezisztenciát kódoló gén inaktiválódik a beleiktatott idegen DNS fragmenstől). A kiválasztott rekombináns DNS molekulákat (pKHSl, pKH82 és pKH83) izoláljuk az E. coli gazdaszervezetekből a plazmid DNS izolálásának hagyományos módszereit követve, és a hibrid molekulákat A'/nd-gyel emésztjük, hogy meghatározzuk a beiktatott fragmensek orientációját. Bacillus subtilis MI 119 (leu B6, trpC2, r~, m ) törzset [„Restriction Of Plasmid Mediated Transformations in Bacillus subtilis 168” (Plazmid által közvetített transzformáció korlátozása Bacillus subtilis i68-ban), Mol. Gen. Genet. 175, 235 — 37 (1979)], és SL 650 (spoil A 69, trpC2, rif-2) (R. Piggot ajándéka) transzformálunk pKH81- gyel, pKH82-vel és pKH83-mal, hagyományos módszereket alkalmazva [Contente és Dubnau: „Characterization Of Plasmid Transformations In Bacillus subtilis: Kinetic Properties And The Effect of DNA Conformation” (Plazmid transzformációk jellemzése Bacillus subtilis-ben; Kinetikai tulajdonságok és a DNS konformáció hatása). Mol. Gen. Genet. 167, 251 — 58 (1979)]. A megfelelően transzformált Bacillus gazdaszervezeteket azután kanamicinre való rezisztencia és eritromicinre való érzékenység alapján kiválasztjuk. A plazmidok szerkezete ezekben a szelektált, transzformáit Bacillus gazdaszervezetekben megerősíthető olyan .módon is, hogy a plazmid DNS-t izoláljuk a gazdaszervezetekből [Lovett és Keggi- us: „Bacillus Subtilis As A Host For Molecular Cloning”) (Bacillus subtilis, mint gazdaszervezet molekuláris klónozása). Methods in Enzimology 68, 342—47 ( 1979)], és a plazmid DNS-t emésztjük Aha !-gyei. j A bacilus gazdaszervezetet, amelyet transzformálunk pH 81-gyel, pKH82-vel és pKH83-mal, eritromicin gátió koncentráció alatti koncentrációjával (0,05 pg/ml) végzett indukció (abból a célból, hogy az eritromicin rezisztenciát kódoló génbe sktatott polipeptidek szintézisét indukáljuk) után megmérjük olyan termékek termelésére, amelyek HBcAg antigenicitását szilárd fázisú radioímmunassay-ban mutatja (pl. C. J. Burret és munkatársai fentebb idézett munka). Ezek a mérések azt demonstrálják, hogy a transzformált Bacillus gazdaszervezetek termelnek olyan polipepíideket, amelyek a HBcAg antigenicitását mutatják. B példa Ebben a példában leírunk a hepatitisz B belső antigének (HBsAg") fajlagossával rendelkező po’ipeptidek előállítására szolgáló eljárást, amely abból áll, hogy ezt a polipeptidet kódoló DNS fragmenst beiktatjuk egy élesztő kiónozó vektorba, és egy élesztő gazdaszervezetet transzformálunk egy ilyen vektorral, hogy replikálódjék, és kifejezze a beiktatott DNS fragmenst, és termelje a HBsAg polipeptidet. A jelen találmány szerinti megfelelő plazmid DNS-ének 5 pg-ját emésztjük Aval restrikciós endonukleázzal, ahogyan ezt a szállító (New England Biolabs) leírja. Egy 1336 bázispáros fragmenst nyerünk, amely HBsAg-t kódol, beleértbe egy lehetséges pre-HBsAg szekvencia 27 bázispárját (lásd. 2. ábra és Gough és munkatársai fentebb idézett munkáját): az Aval fragmenst az A7ioI nelytől egy Aval helyig terjedő DNS szakaszt kódolja át, ahol az Aval hely 62 bázispárral van a HBsAg kódoló terület és a „belső” kódoló terület közöli elhelyezkedő BamHl helyen túl). Az 1336 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
