196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196236 2 jük, majd 45 °C-ra melegítjük, hogy a profág (kihasadása) meginduljon. 37°C-on folytatott tartós tenyésztés az antigén hatékony termeléséhez vezet, ami a sejteken belül fenntartható, mert ezeket a fág gén termékek nem lizálják a szokott módon és mivel a beépült fág gén nincs kapszidban, hozzáférhető marad a transzkripció számára. A sejtek mesterséges lízise jó termeléssel szabadítja fel az antigént (11. ábra) Az eddig tárgyalt E. coli rendszereken kívül ugyan ilyen műveletekkel növelhetjük más mikrobiális sejtek pl. B, subtilis, termofil baktériumok, élesztők vagy gombák vagy más növényi vagy állati sejti tenyészetek antigén termelését. A B. subtilis esetében a B. licheniformisból izolált, penicillináz determinánsokat hordozó plazmid hasznos kifejeződést szabályozó szekvenciát nyújt erre a célra. HBsAg-t kódoló gén kifejeződésére alkalmas javított rekombináns DNS molekula előállítása A HBsAg-re meghatározott gén és aminosav szekvenciák felhasználhatók a HBsAg génjének kifejeződését célzó módszerek kidolgozására a találmány szerint. A HBV antigenicitást mutató polipeptideket előállító rekombináns DNS molekulákkal transzformált gazdasejtekben még nem figyeltek meg ilyen kifejeződést korábban. A 6—8. ábrák nukleotid szekvenciája a HBsAg-t kódoló g ént az 1437. és 2114. nukleotidok között mutatja. Ez a gén más transzlációs fázisban van (3. olvasó keret), mint a HBV genomban lévő HBcAg-t kódoló gén (1. olvasó keret), 1. 3—9. ábra. Ezért olyan rekombináns DNS molekulát választottunk a HBsAg termelésre, amely a gazdasejt transzformálása közben nem termelt HRcAg-t, viszont kb. 2350 nukléotidből álló beépült HBV DNS-t tartalmazott (a -80-tól 2270-ig elhelyezkedő nukleotidnak megfelelő szekvenciák (a 3—8. ábra szerint). A kiszelektált rekombináns DNS molekula többek között az egész HBsAg-t kódoló gént tartalmazta. A beépült HBV DNS nukleotid szekvencia vizsgálata számos olyan restrikciós endonukleáz célpontot fed fel, amelyek a HBsAg-t kódoló gént tartalmazó fragmentek kihasítását teszik lehetővé. Pl. 1409. nukleotid (Xho), 1410. nukleotid (Taq), 1409. nukleotid (Avyz-I) és 1428. nukleotid (Hha I) (6. ábra). Ezek közül különösen a Hha 1 hasznos, mert a beépült HBV DNS hasadása az 1430. és 1431. nukleotid között megy végbe, ami a HBsAg génjének transzlációs iniciációs kodonja (ATG) előtt csak hat nukleotiddal jelent hasadást. Mind a négy esetben túlterjed a kihasított fragment a választott beépült HBV DNS-en, egészen a megfelelő restrikciós endonukleáznak a rekombináns DNS molekula pBR322 részének nukleotid szekvenciáján belül elhelyezkedő restrikciós endonukleáz célpontjáig. Ezeknek vagy más restrikciós endonukleázoknak használata önállóan vagy kombinációban igen hasznos, lehetővé teszi a HBsAg-t kódoló gén kihasítását az iniciációs kodon előtt, de annak közelében és transzlációs terminációs kodonja után. Természetesen a HBcAg génjének esetében hasonlóan, az egész génnel csak frag-12 mentjeit kell használni a rekombináns DNS molekulákban a HBsAg antigenicitást mutató polipeptidek előállításához a megfelelő gazdasejtekben. 1 Az ilyen emésztéssel nyert HBV DNS fragmenteket a belső antigént kódoló géneknél és génfragmenteknél leírt reakciók sorozatával kezelhetjük, így pl. a fragmentet beépíthetjük a pBR322 penicillin rezisztenciát kódoló génbe (pl. Pst I felismerő hely, 2. ábra), így a HBsAg antigenicitást mutató polipeptidet a ß-laktamdzzal (a penicillináz gén terméke) összekapcsolva kapjuk; egy más esetben a gén fragmentet a pBR322-ben penicillin rezisztenciát és tetraciklin rezisztenciát kódoló gének közé építjük be (Eco RÍ vagy Hind III felismerő helyek) — 2. ábra. Ugyanitt^ lac rendszer kifejeződését szabályzó szekvenciába történő beépülés előtt a /űc-rendszerrel is összekapcsolhatjuk a HBV DNS fragmenteket és ezáltal a lac rendszer (Vgalaklozidáz proteinével egyesült HBsAg-antigenicitást mutató polipeptidet kapunk. A génfragmentet a klónkéző hordozóba a választott kifejeződést szabályozó szekvenciához a lehető legközelebb építhetjük be, ahogy azt a HBsAg-t kódoló génnél már leírtuk, vagy a gén fragmentet a találmány szerint másképp is klónozhatjuk. Illusztrációként az egyik ilyen sémát a 12. ábra mutatja. Az ábra szerint a -80 és 2280. nukleotidok között húzódó beépült HBV DNS-t tartalmazó kiválasztott rekombináns DNS molekulát (3—8.! ábra) a HhaJ-ve 1 végzett lebontással fragmentáltuk. A kapott fragmentet a 3' kapcsolási módszerrel építettük be a pBR322 Pst I helyénél a korábban leírt módon. A rekombináns DNS molekulákkal transzformált gazdasejtek HBsAg antigenicitást mutató polipeptideket termeltek. Más fragmenteket (pl. Ava I, Taq, Xho vagy Pst I (részletes emésztés)) is beépítgettünk a pBR322 Pts I felismerő helyén vagy más helyeken rekombináns DNS molekulák előállítása céljából, amelyek, segítségével HBsAg antigenieitású polipeptideket vagy HBsAg-t kódoló génfragmenteket állíthatunk elő. Ezen felül olyan gén fragmenteket építettünk be, a pBR322-be, amelyeket a Pst I-gyel hasítottunk majd a penicillinázt kódoló gén így nyert fragmentjét tovább emésztettük a penicillináz vagy ß-laktamaz 182. aminosavát kódoló kodonból egy esetben a 32. aminosavat kódoló kodonig és egy másik esetben a polipeptid 13. aminosavját kódoló kodonig. A pBR322-Pst I'-nek ezeket a plazmid származékait is használtuk a HBsAg gén fragmentcknél, amelyek az 1147. nukleotidokból a 1796-ig terjedtek, HBsAg antigenicitást mutató polipeptidek előállítására. A 948. és 1437. nukleotidok közötti nukleotid szekvenciát, amely közvetlenül megelőzi a HBsAg-t kódoló Struktur gént, beleszámíthatjuk a hasznos rekombináns DNS molekulák termeléséhez szükséges fragmentekbe, HBsAg antigenicitást mutató polipeptidek és a HBsAg Struktur gén f ragmentjei előállítása végett. Ez a nukleotid szekvencia a gén prekurzor szekvenciája. A prekurzor szekvenciát és a HBsAg struktúr génjét magában foglaló gén fragmenteket Alit I-gyel (939. nukleotid), Hha I-gyel (900. nukleotid) vagy Hae II-vel (899. nukleotid) hasíthatjuk ki. Az Alu I és Hha I esetében részleges emésztés és a kapott fragmen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
