196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196236 2 riukleotidok közti területről származó mintegy 2350 bázispárból (nukleotidból) álló beépült HBV—DNS-t tartalmazó rekombináns DNS molekulát (pHBV 114) mind Alin I-gycl, mind Eco RI*-vel emésztjük, a -26 és 22 közti nukleotid fragmentet (A fragment) kapjuk, ha viszont egyedül csak Eco RI*-vel emésztjük ugyanezt a rekombináns DNS molekulát, a23—1589 közötti nukleotidokból álló fragmentet (B fragment) kapjuk és kis kitermeléssel még egy fragmentet a 23—576 közötti nukleotidokból (B' fragment). Ezeket a fragmentumok könnyen azonosíthatók a 3—4. ábra alapján és vázlatosan a 10. ábrán szerepeinek. Az A és B fragmentumokat eletkroforézissel frakcionáljuk tisztítás végett, majd az Eco RÍ* kohézi végüknél fogva összekapcsoljuk ezeket és így kombinált fragmentumot kapunk (C fragment). A C fragmentet most egy új, kifejeződést szabályozó szekvenciához kapcsoljuk direkt ligáció útján a helyes transzlációs fázis fenntartására, a fent említett 3' toldási módszerre! vagy szintétikus oligo-nukleotid kapcsolók révén. Ez a kapcsolás nemcsak egy jobb kifejeződést szabályozó szekvencia kihasználását teszi lehetővé a protein termelés növelésére, h^pem azt is lehetővé teszi, hogy a HBcAg-t kódoló gén fragment jobban kapcsolódjon magához a kifejeződést szabályozó szekvenciához és így fokozza a gén fragmentum kifejeződésének szabályzását. Hasonlóan az A és B' fragmentum vagy más fragmentek is összekapcsolhatók, és a kapott fragmentum felhasználása a fenti módon történhet. Ez az eljárás azt mutatja, hogy az adott polipeptidet kódoló Struktur génnek csak egy részét kell használni a rekombináns DNS molekulákban. Az adott kifejeződést szabályozó szekvencia és a választott génfragment iniciációs kodonja közötti távolság további rövidítése céljából a megfelelő fragmentet enyhén kezelhetjük egy a végződésben vagy közelében specifikusan ható nukleáz kombinációval vagy exonukleáz — polimeráz kapcsolt helyreállító reakciót használhatunk a fragmentum start kodonját megelőző fragmentum nukleotidjainak vagy egy részüknek eltávolítására. Egy másik módszer szerint a -26. és 30 nukleotidoknál történt hasítás eredményeképpen kapott Alu I. fragment hasonlóan rövidíthető exonukleáz kezeléssel vagy polimeráz kapcsolású helyreállító reakciókkal, majd Eco RI-vel történő hasítással, a -26 és 22. nukleotid közötti fragment előállítására, amely fragment kifejeződést szabályozó szekvenciához való kapcsolódás előtt képes egyesülni a B fragmentummal. Egy másik út szerint a B fragmentet vagy ekvivalensét a szülő rekombináns DNS molekulából származó megfelelő egyszálú templátjához hibridizálhatjuk annak meghosszabbítása érdekében egy reakció sorozatban DNS polimerázzal és korlátozott számú nukleotid trifoszfáttal úgy, hogy a fragment szál a rekonstruálható legyen a kódoló szekvencia kezdetéhez. A templát szálat ekkor a meghosszabított fragment szállal való kapcsolódás helyén SÍ endonukleázzal hasítjuk és az így kapott fragmentet a kifejeződést szabályozó szekvenciához kapcsoljuk. Többféle kifejeződést szabályozó szekvenciát alkalmazhatunk. Idetartoznak: az E. coli laktóz a peronjárat operátora, promotere és riboszóma kötő és kölcsönható szekvenciái (beleértve olyan szekvenciákat, mint pl. a Shine—Dulgano szekvencia (,,lac”-rendszer); az E, coli triptofán szintetáz rendszerének megfelelő szekvenciái („trprendszer”) a X fág főbb operátor és promoter területei (0,PL cs ROrPr') és fd fág kapszid protein szabályzó régiója. Ezeket a szekvenciákat tartalmazó DNS fragmentumokat ezután restrikciós enzimekkel kihasítjuk a lac vagy trp operonokat hordozó transzdukciós fágokból izolált DNS-ből vagy a X vagy fd fág DNS-ből. Ezeket a fragmentumokat ezután a HBV antigén szekvenciánál megjelölt módon kezeljük, hogy egy korlátozott molekula populációt kapjunk úgy, hogy a lényeges szabályzó szekvenciákat a kívánt antigént kódoló szekvencia iniciációs kodonjához igen közel vagy mellé kapcsoljuk mint a C fragmentum esetében, (lásd fent) A fúzió tc-’-mékét a megfelelő gazdasejtek transzformála.'.J.a szolgáló klónképző hordozóba építjük be és az antigén termelés fokát a sejtek lízisc után radioimmunvizsgálattal határoztuk megy. Ily módon kiválaszthatók a leghatékonyabb kifejeződést adó sejtek. Alkalmazhatunk egy iniciációs kodonhoz kapcsolt és lac,trp vagy XPL szabályzó rendszert hordozó klónozó szereket is és egy HBV antigénképességű polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó fragmentummal egyesíthetjük úgy, hogy a struktúr gén fragment helyesen legyen lefordítva a klónképző hordozó iniciációs kodonjából. Bár a fenti kísérletek kifejezetten a HBV belső antigén termelésére irányultak, alkalmazhatók más gének, pl. HBsAg és HBeAgés fragmentumaik kifejeződésének javítására is. A fenti antigének sejten belüli termelésének további fokozása attól függ, hogy a sejtben hasznosítható gének száma hogy nő. Ezt szemléltető célból úgy végeztük, hogy a fent leírt módon felépítő rekombináns DNS molekulákat a „mérsékel” X bakteriofágba építettük bele, legegyszerűbb módon a plazmidot restrikciós enzimmel (pl. Eco Rí vagy Hind III) emésztve, majd az így nyert lineáris molekulát restrikciós enzimekkel kezelt X fág klónképző hordozóval fpl. N. E. Murray és társai által leírt klónképző hordozóval: „Lambdoid Phages That Simplify The Rexovery Of In Vitro- Reeombinants”, Molec. gen. Genet. 150, 53—61. o. (1977). és N. E. Murray és tsai, „Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4”, J. Mol. Biol., 132, 493-505 o. ( 1979)I. valamint DNS ligázzal inkubált kapott rekombináns DNS molekulával összekeverve. Az eljárást all. ábra szemlélteti. A kívánt rekombináns fágot az antigénhez ezután a megfelelő antigénhez tartozó radioimmunoteszttel vagy radioaktív jelzéssel ellátott HBV DNS szekvenciákkal végzett hibridizációval választottuk ki és a fággal az E. coli gazdatörzset lizogén reakciónak vetettük alá. Egy különösen hasznos X klónképző hordozó egy hőmérsékletre érzékeny mutációt tartalmaz a repressziós cl génben és szupressziós mutációkat az S génben melyek terméke szükséges a gazdasejt líziséhez, és tartalmaz továbbá E gént, amely termék a vírus fő kapszid proteinje. Ebben a rendszerben a lizogén sejteket 32°C-on tenyészt11 5 10 15 20 25 30 35 •10 45 50 55 50 65
