196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196 238 2 Á találmány tárgya eljárás HEPATITIS B VÍRUS antigenicitást mutató polipeptidek előállítására. A találmány közelebbről a megfelelő gazdasejt szervezetekben kifejezett rekombináns DNS molekulákra, és előállítására vonatkozik. Ezeket a DNS molekulákat olyan DNS jellemzi, amely a hepatitisz B vírus antigénekre specifikus polipeptideket kódolja. A rekombináns DNS molekulákat a hepatitisz B vírus kimutatására emberben, továbbá a vírus ellenanyagainak szintézisének fokozására használhatjuk. Úgy tűnik, hogy a hepatitiszt vagy a szérum hepatitiszt okozó vírus csak az embert fertőzi meg. A hepatitisz B vírus (HBV) fetőzés igen elterjedt az embereknél. Az Amerikai Egyesült Államokban, Nagy-Britanniában és Nyugat-Európában a véradóknak mintegy 0,1%-a krónikus HBV hordozó. Bár a vírusos hepatitisz következtében bekövetkező halálozási arány nem magas (Nagy-Britanniában minden millió emberre 3), jelek szerint az összlakosság 5%-a Nagy-Britanniában és 15%-a az Amerikai Egyesült Államokban átesett a fertőzésen. Sok afrikai és ázsiai országban egészen 20%-ig terjed azoknak a száma, akik krónikus HBV hordozók és ezekben az országokban a felnőtt lakosság több mint 50%-a fertőzött volt vagy fertőzött HBV-sal. A hepatitisz fertőzés három fő mechanizmus útján terjed. 1) fertőzött vér vagy testfolyadék parenterális beoltása révén, vértranszfűzióval nagy mennyiségben vagy véletlen tűszúrással kis mennyiségben, 2) szoros családi vagy szexuális kapcsolat útján és 3) a terhesség ideje alatt megfertőzött néhány anya útján, akik újszülött gyereküket megfertőzik. Természetes körülmények között a HBV nem nagyon ragályos. Belélegzéssel igen ritkán terjed, ha terjed egyáltalán, A legtöbb HBV fertőzés szubklinikus. A klinikai betegség rendszerint 3—6 hétig tart és lehet enyhe lefolyású vagy megnyilvánulhat heveny akut májgyulladásban, melyet májzsugorodás, sőt halál is követhet. A klinika és szubklinikai HBV fertőzésekből rendszerint teljes a kigyógyulás. Komoly és hosszantartó következmények léphetnek azonban fel néhány esetben: 1) az akut fertőzések kb. öt százalékában a fertőzött egyén krónikus hepatitisz B vírus hordozó lesz és folyamatosan megfertőzhet másokat és májkárosodás léphet fel. 2) Valószínű, hogy egy lefolyt HBV fertőzés teljesen vagy részben okozhatja a krónikus aktív hepatitisz, májzsugorodás és primér májrák HBV szeronegatív eseteinek túlnyomó részének kialakulását. A molekuláris biológia legújabb eredményei lehetővé tették a specifikus nembakteriális eukariota proteineket hordozó DNS bevezetését a baktérium sejtekbe. Általában a nem kémiai úton szintétizált DNS esetében a rekombináns DNS molekulák felépítése során a kívánt protein tisztított messenger (mRNS) templátjának egyszálú DNS kópiáját (cDNS) állítjuk elő, majd a cDNS-t kettősszálú DNS-sé alakítjuk, a DNS-t egy megfelelő klónképző hordozóban a megfelelő helyhez kapcsoljuk és a gazdasejtet ezzel a rekombináns molekulával transzformáljuk. A transzformáció révén az gazdasejt a kívánt proteint termeli. Ezen kívül, legalábbis az ovalbumin DNS esetében is- ( meretes, hogy egy DNS fúziója egy erős bakteriális promoterrel vagy a kifejeződést szabályozó szekvenciával nagy mennyiségű kívánt ovalbumin proteint, azaz egy E. coli sejt összfehérje mennyiségének 0,5— 1 %-át termeli [O Mercereau—Puilalon és társai, „Synthesis Of An Ovalbumin —Like Protein By Escherichia coli K12 Harboring A Recombinant Plasmid", Nature, 275, 505—510 [1978] és T. H. Fraser és B. J. Bruce, „Chicken Ovalbumin Is Synthesized and Secreted By Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 5936-5940 0. [1978]]. Szamos nem-bakteriális proteint és gént szintetizáltak már a rekombináns DNS technológia alkal mazásával. Idetartozik egy patkány proinzulin antigén determinánsokat mutató protein [L. Villa — Komaroff és társai, „A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin”, Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 75, 3727—3731 [1978]), patkány növekedés hormon (P, H. Seeburg és társai, „Synthesis of Growth Hormone By Bycteria’, Nature, 276, 795—798 [1978]), egér dihidrofolát reduktáz (A. C. Y. Chang és társai, „Phenotypic Expression in E. colii Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reductase”, Nature215, 617—624o. [1978], somatosztatin (K. Itakura és társai, „Expression', In Escherichia coli Of A. Chemically Synthesized' Gene For The Hormone Somatostatin”, Science, 198, 1056-1063 o. (1977)), 2007 675A, 2 007 676A és 2 008 123A számú nagy-britanniai szabadalmi leírások) és a humán inzulin A és B polipeptid láncai (D. V. Goeddel és Társai, „Expression in Escherichia coli Of Chemically Synthesi zed Genes For Human Insulin”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 106—110 o. [1979]) és a megfelelő fent említett angliai szabadalmi leírások). Egyik fenti irodalom sem utal azonban vírusod proteinek pl. a hepatitisz B vírus antigének rekonbináns DNS szintézisére. Ismeretes, hogy a HBV fertőzések során ellenanyagok keletkeznek a vírusok antigénjeivel szemben. Ezek az antitestek képviselik a test védekező mechanizmusát a HBV fetózéssel szemben. Az ilyen antitestek kifejlődése a fertőzés előtt vagy gyors kifejlődése a potenciális fertőzés esetében lényegesen csökkenti vagy megakadályozza a vírus növekedését és elterjedését a szervezetben. A mesterséges antitest termelést a hepatitisz B vírusok antigénjei ellen a vírus gazdák korlátozott száma mitálja. Például míg a hepatitisz B vírus igen fertőző az emberre, csak kevés fő emlős állat esetében sikerült fertőzést előidézni. A vírus nem is szaporodott a szövettenyészetben. Ez a korlátozott vírus-gazda „szám” és az a tény, hogy a szöveítenyészetek sejtjeit nem sikerült megfertőzni, komolyan gátolja a vírus és a fertőzés patológiájának jellemzését és gyors kimutatási módszerek és a fertőzés hatékony megelőzésének illetve legyőzésének kidolgozását. Történtek próbálkozások HBV fertőzések áldozataiból izolált autentikus HBV vírus antigének alkalmazására ellenanyag kifejlesztése és a fertőzés kimutatása céljából, ezek a kezelések általában nem alkalmazhatók az aktív speciesek korlátozott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
