196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196236 2 száma miatt. Az emberbői származó antigének nem mindig előnyösek a jólismert szennyeződési probléma miatt, amely az emberből izolált antigéneknél fellép. A találmány szerint a fenti problémát egy rekombináns DNS molekula előállításával oldjuk meg, mely szerint egy struktúrgén kódolja a HBV antigénképességet mutató polipeptidet A találmány szerint HBV antigéneket és géneket sikerül előállítani szennyeződésmentesen és kvantitatív mennyiségben, amelyek vírus vakcina készítményekben alkalmazhatók és felhasználhatók a vírus fertőzés kimutatására és pathológiájának és molekuláris biológiájának meghatározására. Ez eddig nem volt lehetséges a kisszámú vírus-gazda miatt és mert nem sikerült a szövet kultúrák megfertőzése. Ahogy az alábbiakból kitűnik, a rekombináns DNS molekula egy megfelelő gazdaszervezetben képes legalább egy HBV vírus antigénképességet mutató vírus polipeptid és az azt kódoló gének termelésére. A termékek azonosíthatók és jellemezhetők és vagy a gazdaszervezetben létrejött formában vagy tovább alakított vagy módosított készítmények formájában hasznosíthatók. A találmány kiterjed a termékek előállításának javítására, a HBV fertőzés kimutatására, patológiájának meghatározására és emberben a HBV antitestek termelésének fokozására. A találmány szerint a rekombináns DNS molekulákat úgy állítjuk elő, hogy egy Dane-féle részecske endogén DNS-éből előállított DNS szekvenciát összekapcsolunk egy nem-Dane-féie részecske. forrásból kapott DNS szekvenciával. A fent ismertetett korábbi eljárásokból eltérően a találmány szerinti eljárás szerint egy adott protein természetes DNS-ét vagy génjét használjuk a rekombináns DNS molekula felépítéséhez és ennek a proteinnek vagy génnek az előállításához. Az ismert eljárások vagy kémiailag szintetizált géneket vagy a donor sejtekből izolált niRNS enzimes másolásával kapott mesterséges gone két alkalmaznak, és így cDNS szekvenciákat kapnak. Az egyik ok, amiért az ismert eljárásokban nem használtak még közvetlenül természetes DNS-t a proteinek rekombináns DNS-ének szintetizálására, hogy a legmagasabb rendű organizmusokból izolált természetes DNS-k és legalább néhány állati vírus „intronokat” vagy a gén részeként további nukleotid szekvenciákat tartalmaznak. Ezek az iníronok nem képezik részét a génből jövő végső üzenetnek. Ahelyett a magasabb rendű szervezetekben speciális, a primér transzkripciós termékre ható enzimek in vívó távolítják el az intronokat és így a gén végső mRNS információját adják. A baktériumok feltehetőleg nem képesek az intronok feldolgozására, ezért az lenne a várható, hogy a természetes DNS nem fejeződik ki a baktérium gazdasejtben és hogy ezek a gazdasejtek nem termelik a kívánt fehérjéket. Az alábbiakban az ábrák rövid magyarázata következik: l. ábra egy Dane-részecske endogén DNS-ének szerkezetét ábrázoló egyszerűsített diagram. Az ábra két komplementer DNS szálat, az a és b szálat, az a szálban lévő bemetszést és a b szálban támadt hézagot és a hézag DNS polimeráz reakcióval történő kitöltését mutatja. A 2. ábra a találmány szerinti eljárás egyik előnyös fogartatösítási módját szemlélteti vázlatosan. A Dajie-fészecskékból izolált endogén DNS fragmentjeit az E. coli penicilináz génnel egyesítjük a pBR322 plazmidon a Pst 1 helyen. Egyesítjük E. coli HBiOl baktériummal transzformálás után a pBR322-Psî I dG: HBV-KpnI dC rekombináns DNS molekula irányítja a HBV antigenicitást mutató polipeptidek szintézisét. A 3—9, ábra a találmány szerinti hepatitisz B vírus genom egy részét meghatározó nukleotid szekvenciát mutatja. A szekvenciát a felette elhelyezett három leolvasó keretben lévő stop kodonokkal együtt mutatjuk be. Tetszés szerint számozható a HBcAg-t kódoló gén iniciációs kodontól kezdve. A -80 -(-1) nukelotidok a gént megelőző vezçtô szekvenciát képviselik. Az 1—549. nukleotidok a hepatitisz B vírus belső antigént kódoló nukleotid szekvenciát reprezentálják és ennek az antigénnek az aminosav szekvenciáját (1 olvasó keret) efölött á szekvencia felett ábrázoljuk. A 1437—2114 sz. nulkeotidok a hepatitisz B vírus felületi antigént kódoló génre meghatározott nukleotid szekvenciát képviselik és az antigén aminosav szekvenciáját (3 olvasó keret) a szekvencia felett ábrázoljuk. Az ezekben a génekben lévő különböző restrikciós endonukleáz felismerhető helyeket is ábrázoltuk, a 3—9. ábrán. A 10. ábra vázlatosan mutatja a találmány szerinti eljárást, mely szerint a hepatitisz B vírus belső antigénicitást jelképező polipeptid termelésére képes rekombináns DNS molekulát fragmentekre osztjuk és ezekből egy fragmente! egy javított kifejeződést szabályzó szekvenciához, a lac rendszerhez kapcsolunk. All. ábra a találmány szerinti eljárási szemlélteti, amely szerint a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát fragmentáljuk és egy fag DNS-hez kapcsoljuk, melyet gazdasejtek lizogenizálására használunk fel és ezáltal növeljük az ott levő gén-másolatok számát. A 12. ábra a találmány szerinti eljárás egy másik foganatosítás! módját mutatja: a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát, amely nem képes hepatitisz B vírus belső antigént mutató polipeptid termelésére, fragmentáljuk, hogy a HBsAg-ból a Struktur gént eltávolítsuk és ezt a Struktur gént használjuk majd fel a rekombináns DNS molekula előállítására, amely megfelelő gazdában HBsAg-t termel A leírásban a továbbiakban használt fogalmak magyarázata: nukleotid: DNS vagy RNS monomer egysége, amely cukorcsoportból (pentózból) foszfátból, és egy nitrogéntartalmú heterociklusos bázisból áll. A bázis a glükozid szénatomon keresztül (pentózi szénatomén keresztül) kapcsolódik a cukorvázhoz és ez a bázis és cukor kombináció egy nukleozidot ad. A bázis jellemzi a nukleotidot. A négy DNS bázis az adenin („A”), a guanin („G”), citozin („C”) és a timin („T"). A négy RNS bázis az A, G, C és az uracil („U”). DNS szekvencia: A szomszédos pentózok 3' és 5' szénatomja közötti foszfodiészter-kötéssel egymáshoz kötött nuklcotidok lineáris sorozata. 5 10 15 20 25 30 35 43 45 50 55 50 65 3
