196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196229 2 következő eljárás szerint választunk szét két fő összetevőjére. b) Az előbbiek szerint kapott vizes elegyet (750 ml) felvisszük egy Sepharose-D-alanil-D-alanin kromatográfiás oszlopra, amelyet a 8. eljárással kapcsolatban leírt módon állítottunk elő (100 ml duzzasztott gyanta lOmM trisz-HCl pufferben, pH 7,5; az ágy magassága 10 cm). 200 ml, NaCl-ra 2M pH 7,5 0.05M NHtOH-HCl puffert (B puffer) vezetünk át az oszlopon, majd az A 40926 antibiotikum aglikont szelektíve eltávolítjuk az oszlopról, 1500 ml, NaCl-ra 2M pH 9,5 0,05M NH4OHHCllel (C puffer) végezve az eluálást. Ezután az N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet 0,1M vizes ammóniával (D puffer) eluáljuk. Az eluált frakciókat kb. pH 7,5-re állítjuk be és antibiotikum tartalmuknak megfelelően ősszeöntjük, majd a különböző antibiotikum-tartalmú oldatokat Sepharose-D-alanil-D-alanin oszlopon kromatografáljuk (100 ml duzzasztott gyanta lOmM trisz-HCl pufferben, pH 7,5; az ágy magassága 10 cm). Desztillált vizet vezetünk át az oszlopon, a szervetlen sók kimosásáig. Ezt követően az antibiotikumokat 0,1N vizes ammóniával eluáljuk. Ezeket az eluált frakciókat antibiotikum tartalmuknak megfelelően összeöntjük, csökkentett nyomáson, n-butanollal végzett azeotróp desztillálóval kis térfogatra töményitjük be és liofilizáljuk. így 201 mg N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet ill. 236 mg A 40926 antibiotikum aglikont kapunk. Az előbbiekben leírt kísérletet megismételve, de 95:5 DMSO:37%-os HC1 elegyet alkalmazva, kb. 40 °C-on kb. 5 napon át, az N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex kitermelése kb. 15%-kal nő, míg az A 40926 antibiotikum ágiikon kitermelése megfelelően csökken. Ezeket a kísérleteket A 40926 antibiotikum komplexből, A 40926 antibiotikum A faktorból, A 40926 antibiotikum B faktorból, A 40926 antibiotikum B0 faktorból, A 40926 antibiotikum PA faktorból és A 40926 antibiotikum PB faktorból kiindulva megismételve lényegében ugyanezeket az eredményeket kapjuk (azaz a kitermelések a ± 5% tartományban váltakoznak). Közelebbről: A 40926 antibiotikum A faktorból vagy PA faktorból kiindulva a kapott termék az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktor, míg az A 40926 antibiotikum PB fáktorból vagy Bo faktorból kiindulva a kapott termék az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B0 faktor. Az A 40926 antibiotikum B faktorból kiindulva az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B0 és Bi faktor keverékét kapjuk, amelyet HPLC-vel választhatunk szét. 2. példa Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A, Be és Bi faktor szétválasztása. 20 mg A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet 1 ml pH 6,0 18mM nátriumfoszfát pufferben oldunk, amely 10% acetonitrilt tartalmaz. Az oldatot egy preparatív HPLC oszlopba injektáljuk (7 mm belső átmérő x250 mm; 7 pm részecskenagyságú Lichrosorb RP 18 — Merck Co. — szilanizált szilikagél). Az oszlopot 5 ml/perc sebességgel A és B fázissal eluáljuk (lineáris grádiens 10%—55% A fázissal, 55 perc alatt). A fázis: 30/70 18mM nátriumfoszfát/CHbCN, NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva B fázis: 90:10 18mM nátriumfoszfát/CHsCN, NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva. Meghatározzuk az oszlopról eluált frakciók UV abszorpcióját 254 nm-en és az azonos koncentrációjú eluált frakciókat összeöntjük. Három eluátum-csoportot különítünk el; ezek az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A, B0, illetőleg Bi frakciót tartalmazzák. A tisztított A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon faktorokat tartalmazó eluátumokat, amelyeket 11 egymásutáni kromatográfiás elemzés során kapunk, összeöntjük és a szokásos módon sómentesítjük: felvisszük egy oszlopra, amely 5 ml duzzasztott Sepharose-D-alanil-D-alalint (1. a 8. eljárást) tartalmaz. A sókat 10 ml ImM HCl-lel, majd 5 x 10 ml desztillált vízzel eltávolítjuk, majd az antibiotikumot 5x10 ml 1 tömeg/ ’crf.%-os vizes ammóniával eluáljuk. Azammóniás eluátumokat ezután külön-külön összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. 15 mg A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktort, 51 ng A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronilaglikon B» faktort és 3 mg A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B, faktort kapunk, amelyek fizikokémiai adatait és kémiai képletét a leírásban az előbbiekben közöltük. 3. példa Az A 40926 antibiotikum ágiikon szelektív előállítása a) az A 40926 antibiotikum AB komplexből 750 mg A 40926 antibiotikum AB komplexet — amelyet lényegében a 3. eljárás szerint állitottunk elő — feloldunk 150 ml 9:1 (térf./térf.) dirnetilszulfoxíd 37%-os sósav elegyben és a reakcióelegyet kb. 80 °C-ra melegítjük fel. A reakció előrehaladását HPLC-vel követjük és miután a kiindulási anyagok teljes mértékben reagáltak egymással (kb. 3 óra után), a reakciót (600 ml) hideg vízzel leállítjuk és a kapott keverék pH-ját kb. 7,5-re állítjuk be. Ez az elegy (750 ml) tartalmazza az A 40926 antibiotikum aglikont, amelyet affinitáskromatográfiával különítünk el, Sepharose-D-alanil-D-alanin kromatográfiás oszlopon, amelyet a 8. eljárással kapcsolatban írunk le (100 ml duzzasztott gyanta lOmM pH 7,5 trisz-HCl pufferben; az ágy magassága 10 cm). 200 ml 0,05M NFLOH-HCl-t — amely NaCI-re 2M töménységű — (B puffer) vezetünk ál az oszlopon, majd az A 40926 antibiotikum aglikont szelektíve eltávolítjuk az oszlopról oly módon, hogy azt 1500 ml, NaCI-re 2M pH 9,5 0,05M NRtOH-HCl-lel (C puffer) eluáljuk. Az eluált f akciókat ezután antibiotikum tartalmuknak megfelelően összeöntjük, kb. pH 7,5-re állítjuk be és Sepharose-D-alanil-D-alanin oszlopon kromatografáljuk (100 mj duzzasztott gyanta lOmM pH 7,5 trisz-HCl pufferben; az oszlopban az ágy magassága 10 cm). A szervetlen sók kimosásáig desz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
