196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196229 2 tillált vizet vezetünk át az oszlopon. Az A 40926 antibiotikum aglikont 0,1N vizes ammóniával eluáljuk. Ezeket az eluátumokat csökkentett nyomáson, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be, majd liofílizáljuk. 530 mg A 40926 antibiotikum aglikont kapunk. 4. példa Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex és az A 40926 antibiotikum ágiikon előállítása Az 1. példa szerinti eljárással, azonban kiindulási anyagként az AB komplex helyett 750 mg A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elegyét alkalmazva, 195 mg N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet és 230 mg A 40926 antibiotikum aglikont állítunk elő. A kiindulási anyagok előállítása 1. eljárás: Fermentáció az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel Az A 40926 antibiotikumot termelő Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs ferde zabliszt agar tenyészetét — amelyet 2—3 héten át 28 °C-on növesztettünk — használjuk fel egy 500 ml-es Erlenmeyer lombik beoltására, amely 100 ml következő összetételű táptalajt tartalmaz: 0,5% húskivonat 0,5% autolizált élesztő 0,5% pepton 0,3% hidrolizált kazein 2% glükóz 0,15% NaCl pH 7,5 sterilizálás előtt. A lombikot 28 °C-on forgó rázógépen inkubálják, 200 ford./perc sebességgel, kb. 72 órán át, majd a tenyészetet átvisszük egy fermentorba, amely 4 liter előbbi összetételű táptalajt tartalmaz. Ezt a tenyészetet kb. 72 órán át 28 °C-on tartjuk, miközben kb. 2 liter/perc sebességgel levegőt áramoltatunk be és kb. 900 ford./perc sebességgel kevertetjük a rendszert. Ezt a tenyészetet használjuk fel egy 200 literes fermentor beoltására, amely ugyanezt a táptalajt tartalmazza. Ezt a fermentort 100 liter/perc sebességgel steril levegővel levegőztetjük és kb. 28 °C-on 250 ford./perc sebességgel kevertetjük. Az antibiotikum-termelést papírkorongos agardiffúziós módszerrel követjük, minimális táptalajon B. subtilis-t alkalmazva kísérleti organizmusként. A maximális aktivitást 72—96 óra után érjük el. 2. eljárás Az A 40926 antibiotikum kinyerése A) Az előbbiek szerint előállított fermentlevet 4 °C-ra hűtjük, pH-ját 9,5-re állítjuk be és kevertetjük. Kb. 1 óra elteltével szűrjük és a szűrlet pH-ját vizes ásványi savval kb. 3,5-re állítjuk be. A keveréket 30 percen át 4 °C-on kevertetjük, majd segédanyaggal (Hyflo—FloMaR) szűrjük. A tiszta szűrletet elvetjük és a szűrőlepényt ionmentesített vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH-ját kb. 8,5-re állítjuk be, kevertetjük, majd szűrjük. A kinyert szűrőlepényt ugyanennek az eljárásnak vetjük alá. Az összeöntött szűrletek tartalmazzák az A 40926 antibiotikumot. B) Az 1. eljárás szerint előállított fermentléhez (miután szűrtük és a tiszta szűrlet pH-ját kb. 8,5-re állítottuk be), vagy a 2. A) eljárás szerint kapott összeöntött szűrlethez 2 liter módosított duzzasztott D-ala-D-ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose mátrixot adunk, A szuszpenziót egy éjjelen át szobahőmérsékleten kevertetjük, a gyantát szűréssel kinyerjük és egymás után a következőkkel mossuk: kb. 2x10 liter 0,45mM pH 7,5 trisz—HCl puffer (trisz = 2-amino-2-hidroxi-metil-l ,3-propándiol), amely 5 tőmeg/térf.% NaCl-t tartalmaz, majd 4 X 20 liter desztillált víz. A gyantáról az antibiotikumot 2x20 liter 1 tömeg/térf.%-os ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumokat egy éjjelen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd kis térfogatra (kb. 2,5 liter) töményítjük be. A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval távolítjuk el. Ezután petrolétert adagolunk; ennek hatására 3,4 g nyers A 40926 antibiotikum komplex csapódik ki. 3. eljárás Az A 40926 antibiotikum AB komplex tisztítása A lényegében a 2. eljárás szerint előállított nyers A 40926 antibiotikum komplexet (750 mg; HPLC titer 70%) 400 ml vízben oldjuk, az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be és szűrjük. A szűrletet affinitáskromatográfiának vetjük alá D-ala-D-ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon (50 ml duzzasztott gyanta; az ágy magassága 5 cm). Az oszlopot NaCl-ra 2M töménységű 0,16 tömeg/térf.%os, pH 7,5-re sósavval beállított ammóniával hozzuk egyensúlyba és egymás után a következő három puffer oldattal fejlesztjük ki: A puffer: NaCI-ra 2M, sósavval pH 7,5-re beállított 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia (2,6 ágytérfogat); B puffer: NaCl-ra 2M, sósavval pH 9,5-re beállított 0,16 súly/térf.%-os ammónia (16 ágy-térfogat); C puffer: pH 11,4 1 tömeg/térf. %-os vizes ammónia (2,6 ágy-térfogat). ___ A C pufferrel az A 40926 antibiotikum komplexet egyetlen frakcióban eluáljuk. Ezt az eluált frakciót pH 7,0-re állítjuk be és újra felvisszük ugyanerre az affinitás-oszlopra, amelyet lOmM pH 7,0 trisz—HCl pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot a sómentesítés befejeződéséig desztillált vízzel mossuk. Ezután 2 ágy-térfogatnyi pH 11,0 0,39 tömeg/ térf.%-os vizes ammóniával eluáljuk az antibiotikumot. Az eluált frakciókat kis térfogatú vizes eleggyé töményítjük be, majd fagyasztva szárítjuk. 374 mg tiszta A 40926 antibiotikum AB komplexet kapunk. 4. eljárás Az A 40926 antibiotikum A és B faktor szétválasztása A) 3,3 g, a 2. eljárás szerint előállított A 40926 antibiotikum komplexet vagy 2,3 g, a 3. eljárás szerint előállított A 40926 antibiotikum AB komplexet 0,5 liter vízben szuszpendálunk, kevertetünk, majd szűrjük a szuszpenziót. A tiszta szűrletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (200 g; ágy-magasság 18 cm; szilanizált szilikagél 60; 70— 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
