196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196229 2 mussal. Az érzékeny mikroorganizmusok közé tartozik a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus. A kromatográfiás eljárás lefolyása előnyösen követhető TLC vagy HPLC technikákkal is. Kitüntetett HPLC technikát képvisel az olyan fordított fázisú HPLC, amelynek során porózus, gömbalakú szílanizált szilikagél részecskéket használunk fel az oszlop megtöltésére. Ezt ez eljárást az előbbiekben ismertettük, a HPLC eljárásnak az A 40926 antibiotikumok elemzésére való felhasználá- * sa tárgyalásakor. A hasonló antibiotikus aktivitást mutató frakciókat összeöntiük és az előbbiekben leirt módon sómentesítjük. így lényegében tiszta A 40926 antibiotikum A, B, Bo, PA és PB faktorhoz jutunk. A lényegében tiszta A 40926 antibiotikum A faktórt, A 40926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum feo faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort és A 40926 antibiotikum PB faktort az ezeket tartalmazó frakciókból számos ismert eljárással nyerhetjük ki, amilyen pl. a liofilizálás, kicsapás nem-oldószerekkel vagy kicsapás a vizes oldat pH-jának megváltoztatásával. Egy kitüntetett eljárás abból áll, hogy olyan oldószert adagolunk, amely képes vízzel azeotróp elegyeket képezni, azeotróp desztillációval eltávolítjuk a vizet, majd egy — pl. az előbbiekben ismertetett — nem-oldószert adunk a maradékhoz és a képződött csapadékot szűréssel összegyűjtjük. Legalábbis bizonyos fermentációs körülmények között az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor az A 40926-ot termelő mikroorganizmus fő antibiotikum terméke. Az A 40926 antibiotikum A és B faktor főként az A 40926 antibiotikum PA, illetőleg PB faktor átalakulási terméke és gyakran már a fermentlében jelen van. Azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítható az A 40926 antibiotikum A faktorrá, az A 40926 antibiotikum PB faktor pedig A 40926 antibiotikum B faktorrá, bázisos körülmények alkalmazásával. Az A 40926 antibiotikum PA faktor és az A 40926 antibiotikum PB faktor A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá alakítható át pl. 0,5—10%-os vizes ammóniával vagy más nukleofil bázissal — pl. egy szerves aminnal — szobahőmérsékleten, 8—24 órán át végzett kezeléssel. Következésképp: ha egy A 40926 antibiotikumot tartalmazó fermentlevet, koncentrátumát vagy kivonatát bizonyos körülmények között állni hagyjuk (pl. egy nukleofil bázis vizes oldata hozzáadása után, pH 9 fölött, egy éjszakán át), olyan A 40926 antibiotikum komplexet kapunk, amely az A 40926 antibiotikum A és B faktorban feldúsult. Ha rövid az az idő, amelyen át a fermentlevet, ennek kivonatát vagy koncentrátumát a bázisos körülményeknek kitesszük, olyan A 40926 antibiotikum komplexet kapunk, amely az A 40926 antibiotikum PA és PB faktorban dúsult fel. Ezért egy kitüntetett eljárás az olyan A 40926 antibiotikum komplex előállítására, amely A és B faktorban feldúsult, abból áll, hogy az A 40926 antibiotikum komplex oldatát (amely főként A 40926 antibiotikum PA és PB faktort tartalmaz) szobahőmérsékleten 8—12 órán át állni hagyjuk egy vizes nukleofil bázis oldatban — pl. vizes ammónia oldatban —, majd az előbbiekben leírt módon elkülönítjük a keresett antibiotikum komplexet. Az A 40926 antibiotikumot tartalmazó oldatokra példák a fermentlevek, kivonatok és az affinitáskromatográfia során eluált frakciók. Ha a nyers komplexet az előbbiekben leírt módon, affinitáskromatográfiával tovább tisztítjuk, tiszta A 40926 antibiotikumot kaphatunk. Az így kapott termékre, amely a tiszta faktorokból leszármaztatható biológiai és fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, a példákban mint A 40926 antibiotikum AB komplexre fogunk hivatkozni. Egy.kitüntetett eljárás egy A 40926 antibiotikum komplex készítmény PA és PB faktorban való dúsítására abból áll, hogy az affinitáskromatográfia során eluált frakciókat gyorsan semlegesítjük egy savval, előnyösen egy ásványi savval, pl. kénsavval vagy sósavval. ^ A tiszta A 40926 antibiotikum PA és PB faktor ebből a komplexből való elkülönítését valamelyik, az előbbiekben ismertetett eljárás szerint végezhetjük. Egy kitüntetett eljárást képvisel a fordított fázisú folyadékkromatográfia, előnyösen saválló acél oszlopban mérsékelt nyomáson (5—50 bar), vagy nagy nyomáson (100—200 bar). A szilárd fázis lehet egy szílanizált szilikagél, amely a szénhidrogén fázisban 2—18 (legelőnyösebben 18) szénatomos csoportokat vagy fenil-csoportot tartalmaz, az eluálószer pedig egy, az előbbiekben meghatározott poláris, vízzel elegyedő oldószer és a gyantával kompatíbilis pH-jú (előnyösen pH 4—8) vizes oldat — puffer — elegye. Az eluációt a szokásos módon követjük, a homogén antibiotikumot tartalmazó frakciókat összeöntjük és a tiszta vegyületek elkülönítésére, amelyek az alábbi jellemzőkkel rendelkeznek, az előbbiekben leírt módon kezeljük. Bonyolult HPLC elemzéssel kimutatható, hogy az A 40926 antibiotikum B faktor ténylegesen két, Bo és B] faktornak nevezett komponens keveréke. Az A 40926 antibiotikum Bo faktor — amely az A 40926 antibiotikumnak kb. 90%-át teszi ki — azzal jellemezhető, hogy Rt értéke a teikoplanin A2 2 komponenséhez viszonyítva 1,22 a B faktor fizikokémiai jellemzőivel kapcsolatban a következő D) pontban leírt rendszerben; a Bi faktor megfelelő R, értéke pedig — ez az A 40926 antibiotikum B faktor kb. 1,0%-át képviseli — ugyanebben a rendszerben 1,27. A tiszta A 40926 antibiotikum Bo faktort az A 40926 antibiotikum B faktor tovább-tisztításával állítjuk elő, pl. oly módon, hogy megismételjük az elkülönítéshez alkalmazott fordított fázisú kromatográfiás eljárást. Az A 40926 antibiotikum Bo faktor fizikokémiai és biológiai' jellemzői lényegében azonosak az A 40926 antibiotikum B faktoréival, azzal a különbséggel, hogy az előbbiekben említett rendszerekben végzett HPLC elemzés során csak egy csúcsot mutat (a teikoplanin A2 2 komponenséhez viszonyított R, érték a leírt HPLC rendszerben 1,22). Az A 40926 antibiotikum B faktor és az A 40926 antibiotikum B0 faktor között fennálló, az előbbiekben részletezett hasonlóságok miatt a leírásban az A 40926 antibiotikum B faktor biológiai tulaj-5 TÓ 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
