196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
19622'J 2 1 1 donságaival kapcsolatban szereplő utalásokat úgy kell érteni, hogy azok egyben az A 40926 antibiotikum B0 faktorra is vonatkoznak, amely az A 40926 antibiotikum B faktor fő komponense (annak kb. 90%-át teszi ki) és nagy mértékben hozzájárul annak biológiai tulajdonságaihoz. Egy másik megoldás szerint a találmány szerinti antibiotikumok erős vagy gyenge anioncserélő gyanták — ideértve a funkcionálisan átalakított polisztirolt, akril- vagy polidextrán mátrixokat — alkalmazásával különíthetők el a fermentléből vagy tisztíthatók tovább. A gyenge anioncserélők pl. a következő kereskedelmi neveken forgalomba hozott gyanták közül kerülnek ki: Dowex MWA—1 vagy WGR (Dow Chemical), Amberlite IRA—73 (Rohm & Haas), DEAE—Sephadex (Pharmacia). A találmány szerinti eljárásban használható erős anioncserélő gyanták pl. a következő kereskedelmi néven forgalomba hozott termékeket foglalják magukban: Dowex MSA—1, SBR, SBR—P (Dow Chemical), Amberlite IR—904 (Rohm & Haas) és QAF—Sephadex (Pharmacia). A találmány szerinti antibiotikumoknak az ilyen gyantákról való eluálását elektrolitok — pl. nátrium- vagy káliumklorid — vizes oldatainak lineáris grádiens elegyeivel végezzük, amelyeket vízzel vagy víz és egy szerves, vízzel elegyedő oldószer — pl. rövidszénláncú alkohol (pl. 1—4 szénatomos alkohol) vagy egy rövidszénláncú alkil-keton (pl. aceton) — elegyeivel állítunk elő. Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont úgy állítjuk elő, hogy az A és B faktorban feldúsított A 40926 antibiotikum komplexet, az A 40926 antibiotikum A faktort, B faktort, B0 faktort vagy ezek elegyeit ellenőrzött savas körülmények között hidrolizáijuk. Ezeket az ellenőrzött savas körülményeket úgy biztosítjuk, hogy egy ásványi vagy egy erős szerves sav tömény vizes oldatát alkalmazzuk, kívánt esetben egy aprotikus szerves oldószer jelenlétében. Kitüntetett példák az erős ásványi savakra a kénsav és a foszforsav. Kitüntetett erős szerves sav a trifluorecetsav. Kitüntetett aprotikus szerves oldószerek az aliciklusos vagy ciklikus alkil-éterek, amilyen pl. a dioxán és a tetrahidrofurán; a rövidszénláncú alkilszulfoxidok — pl. a dimetil-szulfoxid — és a rövidszénláncú alkil-amidok, pl. a dimetil-formamid. A reakció hőmérsékletét általában 0 C° és a reakcióelegy visszafolyatási hőmérséklete között tartjuk. Sok esetben ez 15 °Cés75 °C között helyezkedik el, míg kitüntetettek a 20 °C és 55 °C közötti hőmérsékletek, és leginkább kitüntetett a szobahőmérséklet. A reakcióidő a reakció konkrét paraméterei függvényében változik és mivel a reakció lefolyása TLC vagy HPLC technikával követhető, a szakember képes a reakció előrehaladásának figyelésére és annak meghatározására, hogy a reakció mikor tekinthető teljesnek. Ennek az eljárásnak egy kitüntetett foganatosítási módját képviseli az A 40926 antibiotikum komplexnek vagy egy tiszta komponensének 80— 95%-os vizes trifluorecetsav jelenlétében szobahőmérsékleten végzett ellenőrzött hidrolízise, az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon előállítására. Ennek az eljárásnak egy másik előnyös módját képviseli az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikonjának 2:1—1:2 vizes 1—2N kénsav és dioxán elegye jelenlétében végzett ellenőrzött hidrolízise. A hidrolízis-lépés végén kinyert nyers A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon tisztítása önmagukban ismert eljárások szerint történhet, amilyen a nem-oldószerek hozzáadásával végzett kicsapás, az oldószerekkel végzett extrakció és a kromatográfia. A kitüntetett kromatográfiás eljárások közé tartozik az oszlopkromatográfia, és a leginkább kitüntetett kromatográfiás eljárás a fordított fázisú oszlop-kromatográfia. Egy alkalmas fordított fázisú folyadék-kromatográfiás eljárás során előnyösen saválló acél oszlopot alkalmazunk mérsékelt (5—50 bar) vagy nagy nyomáson (100—200 bar). A szilárd fázis lehet egy szilanizált szilikagél, 2—18 (előnyösen 18) szénatomos szénhidrogén fázissal, vagy fenil-csoporttal. Az eluálószer egy poláris, vízzel elegyedő oldószer és a gyantával kompatíbilis pH-jú (előnyösen pH 3—8) vizes puffer elegye. Jellemző példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre: vízoldható alkoholok (pl. a metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, alkánkarbonsavak rövidszénláncú alkilészterei (pl. az etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid és ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonitril. Az eluált frakciók antibiotikum tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok valamelyikével — amilyen a papírkorongos vagy az agardiffúziós meghatározás —, érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával állapítjuk meg. Az érzékeny organizmusokra példa a Bacillus subtilis és a S. aureus. A tisztítás, akárcsak a reakció, ugyancsak előnyösen TLC vagy HPLC technikákkal követhető. Egy kitüntetett HPLC technikát képvisel az olyan fordított fázisú HPLC, amelynek során 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált, porózus, gömbalakú szilanizált szilikagélt használunk fel; a gömbalakú részecskék átmérője előnyösen 5 n (ilyen pl. az 5 ura UltrasphereR ODS Altex, Beckman Co.). Elő-oszlopként 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált szilikagéllel töltött oszlopot használunk (ilyen pl. az RP 18 Brownlee Labs), eluálószerként pedig egy — pl. az előbbiekben leírt — poláris, vízzel elegyedő oldószer és egy vizes puffer-oldat lineáris grádiens elegyét. Ezt az oldatot előnyösen pH 5—7-re állítjuk be. Egy kitüntetett eluálószer 5—60% B eluenst tártál-' máz — lineáris grádiens szerinti eloszlásban — A eluensben, ahol az A eluens acetonitril: pH 5—7 vizes puffer 10:90 elegye és a B eluens acetonitril: pH 5—7 vizes puffer 10:90 elegye. Mint ez a 1 zakember számára ismert, belső standardként számos anyag alkalmazható. Ebben az esetben nagyon célszerű belső standard az L 17054 antibiotikum, amelynek retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben közel áll a találmány szerinti vegyületekéihez. Ez a standard anyag ismert: a 0119575 sz. európai szabadalmi bejelentésben írják le. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
