196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196229 2 közé állítjuk be —a micéliumon adszorbeálódott antibiotikum oldatba vitelére, majd a fermentlevet szűrjük. A tiszta szűriet pH-ját 2,5—4,5-re állítjuk be és ismét szűrjük, szűrést elősegítő anyag jelenlétében. A szűrletet elvetjük, a kinyert szűrőlepényt pedig vízben szuszpendáljuk, a pH-t lúgosra — előnyösen 8 és 9 közé — állítjuk be, majd a szuszpenziót szűrjük. A szűrőlepényt ugyanilyen módon kezeljük, az A 40926 antibiotikumot tartalmazó szűrleteket pedig összegyűjtjük. Ezeket a szűrleteket vagy a szűrt fermentleveket ezután rögzített D-alanil-D-alaninon — oszlopban vagy szakaszosan — affinitáskromatográfiának vetjük alá. Az A 40926 antibiotikumnak az affinitást mutató mátrixhoz való kötését előnyösen kb. 7,0—8,0 pH-n végezzük és az eluálást magasabb pH értékeken (előnyösen 9,0 és 10,5 között) hajtjuk végre, vizes bázis segítségével. Ez a vizes bázis lehet ammónia, egy illékony amin, egy alkáli-fém- vagy alkáliföldfém-hidroxid vagy lúgos pufferoldat, adott esetben egy poláris szerves oldószer — pl. a kővetkezőkben meghatározott poláris, vízzel elegyedő oldószer — jelenlétében. A szennyezéseket úgy távolítjuk el, hogy az oszlopot pH 4—8 vizes pufferrel öblítjük át, amely adott esetben sókat, karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket tartalmaz. Ezután az A 40926 antibiotikumot az előbbi eluáió szerekkel eluáljuk. A nyers antibiotikumot előnyösen úgy nyerjük ki, hogy az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókból a vizet egy szerves oldószerrel — amely vízzel minimális azeotróp keverékek képzésére képes — végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, majd a keresett termék kicsapására egy nem-oldószert adagolunk. A következőket jelöljük meg olyan oldószerek jellegzetes példáiként, amelyek vízzel minimális azeotróp elegyeket képesek alkotni: n-butanol, benzol, toluol, butiléter, széntetraklorid, kloroform, ciklohe^án, 2,5-dimetil-furán, hexán és xilol. Az előnyben részesített oldószer az n-butanol. Példák a nem-oldószerekre: petroléter, rövidszénláncú alkil-éterek (pl. etiléter, propiléter és butiléter) és rövidszénláncú alkil-ketonok, pl. aceton. Egy másik megoldás szerint az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókat kis térfogatra töményítjük be — előnyösen egy, az előbbiekben meghatározott szerves oldószerrel végzett azeotróp desztilláció segítségével — és á kapott vizes oldatot liofilizáljuk. Ha az eluáláshoz alkalmazott vizes bázis nem illékony, kicsapás vagy fagyasztva-száritás előtt szükségessé válhat a semlegesítés és a koncentrátum sómentesítése. Egy egyszerű sómentesítési eljárás szerint az antibiotikumot tartalmazó vizes oldatot szilanizált szilikagél oszlopra visszük fel, az oszlopot desztillált vízzel mossuk és poláris, vízzel elegyedő oldószer és víz elegyével eluáljuk. A poláris, vízzel elegyedő oldószerek jellegzetes példái: vízben oldódó alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, rövidszénláncú alkánkarbonsavak rövidszénláncú alkilészterei (pl. etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid és ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonrtril. 12 Egy másik megoldás szerint a sómentesítést úgy hajthatjuk végre, hogy az antibiotikumot tartalmazó oldatot felvisszük az előbbiekben ismertetett affinitás-oszlopra, ezt desztillált vízzel mossuk és egy illékony vizes bázissal eluálunk, amint ezt az affinitáskromatográfiával kapcsolatos eluáció esetére az előbbiekben leírtuk. Az így kapott termék az A 40926 antibiotikum komplex. Ezt szükség esetén tovább tisztíthatjuk vagy megosztásnak vethetjük alá az A, B, B0, PA és PB faktor előállítására. Célszerű eljárást jelent a tiszta A 40926 antibiotikum komplex előállítására az előbbi módon kapott komplex további tisztítása affinitáskromatográfiás oszlopon. Általában az előbb említett stacionárius fázist (D-alanil-D-alanin) alkalmazzuk és a keresett antibiotikumot úgy eluáljuk, hogy az előbbiekben ismertetett, a rögzített D-alanil-D-alanin felhasználásán alapuló affinitáskromatográfiás eljárást követjük. * Kitüntetett rögzített D-alanil-D-alanin a Sepharose-epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-aianin; puffer-elegyként előnyben részesítjük a pH 7—8-ra beállított, NaCI-ra nézve 2M 0,16%-os (tömeg/ téif.) ammóniát. Előnyben részesítjük továbbá a következő oldatok alkalmazását: átöblítő oldatként pH 8—9,5-re beállított, Na—Cl-ra nézve 2M 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia-oldat; eluáió elegyként pH 10,5—12-re beállított, NaCl-ra nézve 2M 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia, mimellett a leginkább kitüntetett eluáló-elegy az előbbi összetételű oldat, pH 11,5-re beállítva. Az A 40926 antibiotikum faktorokat — nevezetesen az A 40926 antibiotikum A faktort, az A 40926 antibiotikum B faktort, az A 40926 antibiotikum Bo faktort, az A 40926 antibiotikum PA faktort és az A 40926 antibiotikum PB faktort — az A 40926 antibiotikum komplex vizes oldatából oszlopkromatográfiával, előnyösen fordított fázisú öszlopkromatográfiával különítjük el. A fordított fázisú oszlopkromatográfia esetében a kitüntetett stacionárius fázis a szilanizált szilikagél. Jó eredményeket kapunk abban az esetben is, ha az oszlopkromatográfiát eredeti (funkcionálisan nem átalakított) polisztirol és akrilsav gyantákon hajtjuk, végre. A kereskedelemben ezek a következő neveken szerezhetők be: Amberlite XAD—2, XAD—4, XAD—7 és XAD—8 (Rohm és Haas), vagy Diaion HP 20 (Mitsubishi). Abban az esetben, ha a fordított fázisú tisztítási lépést stacionárius fázisként szilanizált szilikagélen hajtjuk végre, az oszlopot — egy előnyös megoldás szerint — előzetesen egy pH 4—9 vizes pufferoldattal, előnyösen pH 5,5—6,5 puffer-oldattal hozzuk egyensúlyba, majd egy poláris, vízzel elegyedő oldószerrel (lineáris grádiens képzésével ugyanebben a pufferoldatban) eluáljuk. Jellemző példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre: vízoldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, tetrahidrofurán, dioxán és dimetil-f <rmamid, illetőleg ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer azeacetonitril. Az eluált frakciók antibiotikum-tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok segítségével — amilyen a papírkorongos vagy az agardiffúzíós elemzés — határozzuk meg, valamely érzékeny mikroorganiz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
