196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
196227 2 1 v 7. példa BHA-gyaniához kötött Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe(4 '-Et)- Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos) szilárd fázisú szintézise A cím szerinti gyantához kötött peptidet BHA-gyantához kötött BQC-Arg(Tos)-ból [0,4 millimól/g gyanta] kiindulva az előzőekben ismertetett módszer szerint állítjuk elő, vagyis a védőcsoportot lehasítjuk és az aminosavat kapcsoljuk. A reakciót HBT és DCC segítségével hajtjuk végre 2 órán keresztül, így BHA-gyantához kötött Boc-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-t kapunk. A következő két aminosavat Beckman peptid 990-B szintetizátor segítségével kapcsoljuk. A Pmp(4- -MeBzl)-t manuálisan kapcsoljuk DMAP—DCC elegy ét alkalmazva egy éjszakán keresztül. A gyantához kötött peptidet a szokásos módon mossuk és szárítjuk, Így a cím szerinti intermedier 2,00 g-ját nyerjük. A Prhp-D-Tyr(Et)-Phe(4-Et)-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 előállítása 3 ml anizolban oldott BHA-gyantához kötött Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe(4-Et)-Val-Asn-Cys-4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-t 30 ml hidrogén-fluoriddal reagáltatunk 0 °C hőmérsékleten egy órán keresztül. A fentiekben ismertetett feldolgozási módszert alkalmazzuk, 38 ml kálium-(hexaciano-ferrát)-ot használunk el. 50 mg nyersterméket kapunk a Bio-Rex oszlopról és 139 mg-ot csapunk ki az oldatból, a cím szerinti peptid teljes kitermelése 189 mg (42,7%). Tisztítás 1. Megosztásos oszlopkromatográfia, Sephadex, G—25 Minta: 50 mg, n-BuOH/HOAc/HíO, 4:1:5 a) A frakció 23,86 mg b) B frakció 18,5 mg Preparatív HPLC Minta: 43 mg (az 1/A és 1/B frakcióból) Altex ODS, 10 mmx25 cm, 5p áramlási sebesség: 4 ml/perc, víz/acetonitril/TFA (50:50:0,25), izokratikus, 229 nm (2,0 AUFS), injektálás: 2,0 mg/300 pl és 4,0 mg/420 ml, így 30,0 mg tiszta peptidet kaptunk. 2. Fizikai adatok Képlet: C53H78N12O12S2 Mólsúly: 1106,47 Aminosav analízis: Asp = 1,00, Pro = 0,78—0,84, Cys = 0,45, Val = 1,02, Tyr = 0,63, Phe(p-Et) = 1,50, Arg = 1,00—0,96. Peptidtartalom : 73,3—89,6%. 3. Kromatográfiás adatok: Oldószer Rr TLC n-BuOH/HOAc/HíO/EtOAc 1:1:1:1 0,70 n-BuOH/HOAc/H20 4:1:5 felső 0,299 HPLC Cis-oszlop k' Izokratikus H2O/CH3CN/TFA (55:45:0,1) 4,43 Gradiens H2O/CH3CN/TFA 60:40:0,1-től 50:50:0,1-ig 8,7 FAB m/z 1107 (M + H)+; 1105 (M—H)-8. példa MBHA-gyantához kötött Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos) előállítása Egy millimól MBHA-gyantához kötött Boc-Asn-Cys(4-MeBzI)-Pro-Arg-(Tos)-t állítottunk elő kiindulási anyagként 1 millimól Boc-Arg(Tos)-4- -metil-benzhidril-amin (MBHA)-t használva. A kapcsolási reakciókat egy Beckman 990-B peptid szintetizátorban hajtjuk végre. Az aminosavak /-Boc-védett formáit használjuk. A kapott, 1,83 g védett, gyantához kötött peptidet két egyenlő részre osztjuk, így két 0,915 g-os mintát kapunk. A Pmp-D- Tyr(Et)-Phe-Gly-Asn-cj>s-Pro-Arg-NH} szintézise A kapott, védett, gyantához kötött peptid egyik részéhez további 1,5 millimól mennyiségű, megfelelő Boc-val védett aminosavakat és béta-(S-MeBzl)-Pmp-OH-t kapcsolunk, így 1,16 g cím szerinti, gyanta hordozóhoz kötött peptidet kapunk. Az MBHA-gyantához kötött Pmp(S-Me- Bzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Gly-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg-(Tos) peptidet vákuumban szárítjuk. A kapott védett peptidet 1,5 ml anizollal és 25 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük 0 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül. A védőcsoport nélküli peptidet 0,01 mól kálium-(hexaciano-ferrát)-tal kezeljük pH = 7,2-en, 2 1 víz oldószer jelenlétében. 53 ml oxidáló ágenst alkalmazunk. A kapott oldatot egy Cis flash oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 50%-os, 0,25% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitrillel eluáljuk 20 mles frakciókban. 325 mg nyersterméket tudunk a. frakciókból elválasztani. A terméket a továbbiakban CCD módszerrel tisztítjuk (B/A/W = 4:l :5), így 188 mg/99%-os tisztaságú cím szerinti terméket kapunk. Aminosav analízis: Peptidtartalc m : 82% Asp = 1,04; Ty.=0,92; Pro= 1,15; Phe = 1,01 ; Gly = 1,00; Arg = 0,91. Cys = 0,54; FAB/MS = m/z (M + H)+ 1037 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
