196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196227 2 A Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 előállítása 1,25 g (0,37 millimól), 2 ml anizolban oldott, BHA-gyanta hordozóhoz kötött Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr-(Et)-Phe-Abu-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg (Tos)-t 20 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal reagáltatunk 0 °C hőmérsékleten 50 percig. A hidrogén-fluorid vákuumban való eltávolítása után a maradékot 4 x 20 ml vízmentes éterrel mossuk és a nyers pepiidet 50 ml dimetil-formamiddal és 50 ml 33%-os ecetsavval 21 gázmentesített, 4,5-ösre előzetesen beállított pH-jú vízbe átextraháljuk. A vizes, hígított diszuifhidril-oktapeptidet 0,01 mól/l kálium-ferricianid oldat segítségével pH = 7,2-n ciklizáljuk addig, amíg a sárga szín 30 percig fenn nem marad. Ehhez 50 ml kálium-ferricianid oldatra van szükség. A pH-t jégecettel 4,5-re állítjuk és az oldatot egy gyengén savas akrilgyanta (Bio-Rex-70) oszlopon (2,5 x 12 cm, H+ formában) lassan keresztülvezetjük. Az oszlopot piridin/jégecet/víz 30:4:66 arányú elegyével eluáljuk. A piridin-acetátos oldatot vákuumban desztillációval távolítjuk el. A maradékot 10%-os ecetsavból liofilizáljuk, így 300 mg (76%) nyers, cím szerinti terméket kapunk. A Pmp-D Tyr(Et)-Phe-Abu-Asn-Cys-Pro-Arg-NH: tisztítása 1. Ellenáramú eloszlás Minta: 300 mg, n-BuOH/HOAc/HjO, 4:1:5, 240 frakció ttuivvtv a) 176— 186. frakció 99,6 mg tiszta peptid b) 170—175. és 187—210. frakció 117,24 mg A tiszta anyag kitermelése: 216,84 mg (55%). 2. A molekula összegképlete: C50H72N12O10S2 Mólsúly: 1064,53 Aminosav analízis: Asp = 1,00, Abu + Cys = 1,70, Tyr = 0,64, Phe = 0,98, Arg = 0,91. Peptidtartalom: 68,06—91,52% az aminosav analízis alapján, 87,33%-a a nitrogén analízis alapján. 3. Kromatográfiás adatok: Oldószer Rf TLC n-BuOH/HOAc/HíO/EtOAc 0,56 1:1:1:1 n-BuOH/HOAc/HjO 0,42 4:1:5 felső HPLC CiB-oszlop k' Izokratikus H2O/CH3CN/TFA 3 (60:40:0,25) 0,05 M KHíPO-t/acetonitril 7,33 60:40 Gradiens H2O/CH3CN/TFA 8,82 80:20:0,25-től 50:50:0,25-ig Gyorsított atom: m/z 1065 (M -f H)+ ; bombázás (FAB) 1063 (M—H)~ 6. példa BHA-gyantához kapcsolt Pmp-(4-MeBzl)-D- Tyr-(Et)-Phe-A la-Asn-Cys-4- -MeBzl)-Pro-Arg(Tos) szilárd fázisú szintézise A 0,72 g (0,36 millimól) BHA-gyantára felvitt C-D [Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)] pepiidet Beckman 990-B peptid szintetizátorban szintetizáljuk a Boc-Arg(Tos) benzhidril-amin-gyantához kötött formájából kiindulva [0,72 millimól/g gyanta] az 5. példában leírt módon eljárva. A következő aminosavakat a megfelelő sorrendben HBT és DCC segítségével hasonló módon kapcsoljuk (2 óra). Az utolsó aminosav, vagyis a Pmp(4- -MeBzl) kapcsolása után a gyantához kötött pepiidet a szokásos módon mossuk és a cím szerinti intermedier 0,88 g-ját kapjuk. A Pthp-D-Tyr(Et)-Phe-Ala-Asn-Cys-Pro-Arg-NHi előállítása BHA-gyantához kötött, 2 ml anizolban oldott Pmp(4-MeBzI)-D-Tyr(Et)-Phe-Ala-Asn-CyS(4- -MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-t 20 ml vízmentes hidrogén-fiuoriddal reagáltatjuk 0 °C hőmérsékleten 50 percig. A feldolgozást a szokásos módon végezzük, és 45 ml K3Fc(CN)6 felhasználásával 230 mg (60,8%) nyers, cím szerinti terméket kapunk. A Pfhp-D-Tyr(Et)-Phe-AIa-Asn-Cys-Pro-Arg-NHi tisztítása 1. Ellenáramú eloszlás Minta: 230 mg, n-BuOH/HOAc/H20 4:15 , 240 frakció a) 160—178. frakció 105,2 mg tiszta termék 179—190. és 150—159. frakció 49,5 mg A tisztított termék kitermelése: 154,7 mg (41%). 2. Képlet: C49H70N70O1052 Mólsúly: 1050,449 Aminosav analízis : Asp = 1,00, Pro = 1,03, Alá = 0,94, Cys = 0,46, Tyr = 0,65, Phe = 0,91, Arg = 0,92. Peptidtartalom: 59,18—81,77% két analízis alapján 3. Kromatográfiás adatok: Oldószer Rr TLC n-BuOH/HOAc/H20/EtOAc (1:1:1:1) 0,64 HPLC CiB-oszlop k' Izokratikus H2O/CH3CN/TFA (60:40:0,1) 2,18 Gradiens h2o/ch3cn/tfa 60:40:1-től 6,47 50:50:0,1-ig Gyorsított atombombázás (FAB): m/z 1051 (M + H)+; 1049 (M—H)-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
