196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196227 2 litás eléréséhez (lecsökkentéséhez) szükséges vegyületdózist [jAg/kg] jelenti. A hidropéniás majom vizsgálatát hasonlóképpen végeztük. Az I. táblázat adatai a kiválasztott reprezentáns vegyületek, melyek oktapeptid szerkezetében a találmány szerinti vegyületekre jellemző dez-Gly dipeptid láncvég megtalálható, anti-vazopresszin aktivitását mutatják. A jelentős antagonista aktivitás nem várt, mivel az agonisták között a dez-Gly-oxitocin éppen ellenkező hatást gyakorol a vérnyomásra, mint maga az oxitocin (Berde és munkatársai), és az oxitocin és a vazopresszin láncának megrövidítése az irodalom szerint „a vegyületek tipikus biológiai aktivitásának rohamos csökkenésével jár” (T. Barth és munkatársai). Az I. táblázat 5. vegyületéről a sertés és emberi szövet in vitro vizsgálata valamint a hidropéniás sertés és majom tesztek alapján bebizonyosodott, hogy különleges antagonista aktivitással rendelkezik. A vegyület anti-ADH aktivitása az öntudatánál lévő, hidropéniás mókusmajom vizsgálatban, melyet a vizelet ozmolalitásának 300 milli-Osm/kg víz értékre való csökkentéséhez szükséges anyagmennyiséggel fejezünk ki, EDjoo = 8,6 Nmól/kg (i. p.). Az I. táblázat 4. vegyületének ED300 értéke 33,1 Nmól/kg. Az utóbbi vegyület 2-D-Phe analógjáé 319,0 Nmól/kg. A találmányt az alábbi példákon mutatjuk be anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. 1. példa A Pmp(Bzl)-D- Tyr(Br-Z)-Phe- Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-gyanta szilárd fázisú szintézise A gyantához kötött cim szerinti vegyület szilárd fázisú szintézisére gyantához kötött Boc-Arg(Tos)-t [3millimól/5,4 g gyanta] használunk kiindulási anyagként. A megfelelően védett aminosavakat egymás után kapcsoljuk a Boc-Arg(Tos)-gyantához, melyet Boc-Arg(Tos) cézium-sójának a szakirodalomból ismert módon kereskedelmi Merrifield-gyantával (C1-CH2 gyanta) való reagáltatásával állítunk elő. Az aminosavak kapcsolása során az alábbi lépéseket tesszük: 1. mosás metilén-kloriddal (háromszor, 1 percig), 2. előmosás 33%-os, metilén-kloridban oldott, 1% indolt tartalmazó trifluor-ecetsavval (egyszer, 1 percig) 3. védőcsoport lehasítás metilén-kloridban oldott, 1 % indolt tartalmazó 33%-os trifluor-ecetsavval (20 percig), 4. mosás metilén-kloriddal (háromszor, 1 percig), 5. előmosás metilén-kloridban oldott 10% trietil-aminnal (egyszer, 1 percig), 6. semlegesítés 10% trietil-amin tartalmú metilén-kloriddal (10 percig), 7. mosás metilén-kloriddal (háromszor, 1 percig), 8. hozzáadjuk a trimetil-aminban, metilén-kloridban és 0,5 M N,N'-diciklohexil-karbodiimid tartalmú metilén-kloridban (20 ml) oldott védett aminosavat (10 millimól). A reakcióidő maximálisan 2 óra. Amikor az Asn részt kapcsoljuk, vízmentes dimetil-formamidban oldott 10 millimól 1-hidroxibenzotriazolt (HBT) adunk a Boc-Asn-hez. Vízmentes dimetil-formamidot akkor is használjunk oldószerként, ha Pmp(Bzl)-t kapcsolunk a gyantán évő pepiidhez 4-dimetil-amino-piridint (10 millinól) használva. Mindegyik kapcsolási reakció befejeződését a ninhidrin próbával ellenőrizzük. 4- metoxi-benzil-csoportot használjuk a Cys tiol-csoportjának védelmére, míg a D-Tyr fenolos hidroxil-csoportját 2-bróm-benzil-oxi-karbonil-csoporttal védjük. A kapott védett Pmp(Bzl)-D-Tyr(Br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-gyantát jól megmossuk metilén-kloriddal illetve metanollal. Vákuumban egy éjszakán keresztül való szárítás után 8,4 g cím szerinti, védőcsoportokat tartalmazó, gyantahordozóhoz kötött terméket kapunk. I ■■ ... ............. ... 7 A Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NHi előállítása 4 g, 1,5 millimól Pmp(Bzl)-D-Tyr-(p-bróm-benzil-oxi-karboniI)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-gyantát ammonolízisnek vetjük alá 200 ml ammónia/metanol elegy 50 ml dimetil-formamidos oldatát használva szobahőmérsékleten 48 órán keresztül. Szárazra való bepárlás után a maradékot etil-acetát/n-hexán elegyével kicsapjuk, így védett oktapeptid-amidot kapunk (1,54 g). Ezt a nyers pepiidet 250 ml folyékony ammóniában oldjuk és nátrium/folyékony ammónia oldattal kezeljük, így Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NHí-t kapunk, melyet 4 1 0,01 mól/1 kálium-ferricianid oldat alkalmazásával oxidálunk pH = 7—7,5-en. Az oxidációs reakció befejeződése után a vizes oldat pH-ját 4,5-re állítjuk be jégecet hozzáadásával. Ezt az oldatot lassan egy gyengén savas akril-gyanta [Bio-Rex 70] oszlopon (11 x2,5 cm, H+ fázis) vezetjük keresztül. Az oszlopot 5%os illetve 50%-os ecetsav oldattal eluáljuk. A nyers ciklízált Pmp-D-Tyr-Phe Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NHí-t az 50%-os ecetsavas frakciókból nyerjük (860 mg). A Pmp-D- Tyr-Phe- Val-Asn-Cßs-Pro-Arg-NH2 tisztítása 1. Ellenáramú tisztítás Minta: 860 mg nyerstermék, n-BuOH/HOAc/H20 (4:5:1) 250 transzfer frakció a) 186—204. frakció 436 mg b) 182—185. és205—218. fr. 219mg 2. Megosztásos kromatográfia Minta: 250 m [az 1/a szerinti termékből] finom Sepheiex G—25 (2,5x55 cm) n-BuOH /HOAc/HO (4:1:5) a) 32—46. frakció 22 mg 3. Preparatív nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) Minta: 40 mg a 2/a-ból; Altex Cl8, 20,7 bar túlnyomás Áramlási sebesség: 3,0 ml/perc 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
