196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

196227

2

1 „

a) 46-50. frakció 20 mg

b) 51-77. frakció 60 mg tiszta peptid

4, példa

1----—— --------*—

A Pmp-D-Leu-Phe- Val-Asn-Cys-Pro-A rg-NHC3H7 előállítása

0,1 millimól, a fentiek szerint előállított, de a 2-es helyzetben Boc-D-Leu-t tartalmazó Pmp-D-Leu----------------- —■-----,-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 és 0,1 millimól npropíl-amin 20 ml dimetil-formamidban oldott elegyét 23 mg (0,11 millimól) DCC-vel és 14 mg (0,11 millimól) HBT-vel szobahőmérsékleten, 2 órán keresztül reagáltatjuk. Az illékony anyagokat lepárolva olajos maradékot kapunk. A kapott terméket a következő módon tisztítjuk:

a) gélszűréssel, oszlopként G-10-Sephadexet, eluensként 0,2 N ecetsavat használva,

b) nagynyomású folyadékkromatográfiával, 0,05% TFA-t tartalmazó 39%-os vizes acetonitril oldatot használva, és ismét,

c) gélszűréssel; így a cím szerinti tiszta oktapeptid 20 mg-ját nyertük.

Aminosav analízis:

Asp = 0,88; Leu -1,09%;

Pro = 0,93; Phe = 0,88;

Val = 1,00; Arg =1,07.

HPLC = 95%, fő csúcs 11,33-nál 40%-os vizes, 0,05 M káliumhidrogénfoszfátot tartalmazó acetonitril oldatot használva.

A Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NHí-t melyet a fenti 2. példa szerinti módon állítottunk elő, és benzilamint használva Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-C^s-Pro-Arg-NHBzl-t állítunk elő. A többi N-alkilezett származékokat hasonlóan kapjuk meg.

5. példa

Gyantához kötött Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA szilárd fázisú szintézise

A cím szerinti gyanta hordozóhoz kötött peptid szilárd fázisú szintéziséhez BHA gyanta hordozóhoz kötött Boc-Arg(Tos)-t (1,19 millimól/g gyanta) használunk kiindulási anyagként. 3 millimól Boc-Arg(Tos)-t 1,0 millimól benzhidril-amin-gyantával reagáltatunk dimetil-formamidban 2 órán keresztül. A benzhidril-amin-gyantát a hidroklorid sója formájában egy éjszakán át dimetil-formamidban áztatjuk. Ezután metilén-kloriddal mossuk négyszer 1 percen keresztül, 7% diizopropiletil-amin tartalmú metilén-kloriddal kétszer 2 percig, majd hatszor 1 percig csak metilén-kloriddal, majd végül kétszer 1 percig előzetesen vízmentesített dimetil-formamiddal semlegesítjük. A Boc-Arg(Tos) felvitelét a gyantára kétszer hajtottuk végre 6 millimól 1-hidroxi-benzotriazolt (HBT) és 3 millimól diciklohexil-karbodiimidet (DCC) használva. A kötés után rutinszerű ninhidrin-próbával és aminosav analízissel ellenőrizzük a gyantához

kötés %-os arányát. A megkötés mértéke ebben az esetben 62,66%-os, vagyis 0,74 millimól/g gyanta terméket kapunk. A következő aminosavat, a Boc-Pro-t a következő módon kapcsoljuk a gyanta hordozóra felvitt aminosavhoz:

1. Hatszor 1 percig metilén-kloriddal mossuk,

2. Egyszer 1 percig 50% TFA-t tartalmazó metilén-klorid oldattal előmossuk,

. 3. A védőcsoportokat 50% TFA tartalmú meti:én-klorid oldattal eltávolítjuk (20 perc),

4. Hatszor 1 percig metilén-kloriddal mossuk,

5. 7% DIEA tartalmú metilén-kloriddal egyszer 1 percig előmossuk,

6. 8 percig 7% DIEA tartalmú metilén-kloriddal semlegesítjük,

7- Hatszor 1 percig metilén-kloriddal mossuk,

8. Kétszer l percig dimetil-formamiddal mossuk,

9. 3 millimól, védőcsoporttal védett aminosavat és 6 millimól, dimetil-formamidban oldott HBT-t adunk hozzá, majd

10. Kétszer 1 percig dimetil-formamiddal mossuk,

11. Négyszer 1 percig metilén-kloriddal mossuk, J2. Kétszer 1 percig etanol/metilén-klorid 1:1

arányú elegyével mossuk,

13. Négyszer 1 percig metilén-kloriddal mossuk.

A további aminosavakat a megfelelő sorrendben Beckman peptid 990 B szintetizátort használva kapcsolunk. A kapcsolás menete a Boc-Asn és a Pmp(4-JvkBzl) kivételével a következő:

1. Háromszor 1 percig metilén-kloriddal való mosás,

2. Egyszer 1 percig 50 TFA-t tartalmazó metilén-kjoriddal való előmosás,

3. A védőcsoportok eltávolítása 50% TFA-t tartalmazó metilén-kloriddal 30 percig,

4. Háromszor 1 percig mosás metilén-kloriddal,

5. Egyszer 1 percig előmosás 7% DIEA tartalmú metilén-kloriddal,

6. Egyszer 10 percig 7% DIEA tartalmú metilén-kloriddal való semlegesítés,

7. Háromszor 1 percig mosás metilén-kloriddal,

8. 3 millimól, dimetil-kloridban oldott védőcsoportot tartalmazó aminosavat adunk hozzá, majd 3 millimól DCC-t (10 ml 0,3 M-os metilén-kloridos oldatot) adunk hozzá, és két órán keresztül a kapcsolást végrehajtjuk,

9. Háromszor 1 percig metilén-kloriddal mossuk,

10. Háromszor 1 percig etanol/metilén-klorid 1:1 arányú elegyével mossuk,

11. Háromszor 1 percig metilén-kloriddal mossuk.

Amikor az Asn-részt kapcsoljuk, 6 millimól 1- -hidroxi-benzotriazolt (HBT) használtunk 10 ml 0,6 M-os dimetil-formamidos oldat formájában. Vízmentes dimetil-formamidot használunk oldószerként akk r is, amikor Pmp(4-MeBzl)-t kapcsolunk a gyantához k ütött pepiidhez 3 millimól 4-dimetil-amino-piridin segítségével. Mindegyik kapcsolási reakció befejeződését a ninhidrin-próbával kísérjük figyelemmel. A 4-metil-benzil(4-MeBzi) csoportot a Cys és a pentametilén-merkapto-propionsav (Pmp) részek tiol-csoportjainak védelmére alkalmazzuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

8