196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196227 2 összehasonlító anyag 88%-ához képest). 1,5 g fenti terméket CCD segítségével butanol/víz/ecetsav 4:5:1 deggyel tisztítva 1,13 g terméket kapunk. Kitermelés: 75%. VRK: Rf(B)~0,60, Rf(G) = 0,55. Peptidtartalom HPLC szerint: 99,1% az összehasonlító anyaghoz viszonyítva. Retenciós idő (30 cm, Bondapak C18, acetonitril) 0,05 mól/1 ammónium-dihidrogén-foszfát (pH = 4,4) 30:70, 1 ml (perc) = 30,5 perc, peptid-tartalom: 89%. [«]d25 = —54,5° (c= 1, metanol). Preparatív HPLC oldószerelegyeí : A oldószerelegy: 95% etanol 3450 ml steril víz 4650 ml ammónium-acetát 15,4 ml ecetsav (0,025 mól/1) 12,0 ml B oldószerelegy: 95% etanol 3750 ml steril víz 4250 ml ammónium-acetát 15,4 ml ecetsav (0,025 mól/1) 12,0 ml 18. példa Tmp-D-TyrfEtJ-Phe-Vaï-'Âsn-Cys-Pro-Arg-NHi előállítása Tmp(MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA peptidil-gyanta prekurzort szintetizálunk az 5. példában leírt módon 0,5 mmól mennyiségben. A gyantát 15 ml hidrogén-fluoriddal kezeljük 1 ml anizol jelenlétében 0 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül. A hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, a gyantát etiléterrel mossuk, majd először DMF és utána TFA segítségével extraháljuk. Az extraktumokat 2,0 1 vízzel hígítjuk, majd koncentrált NFLOH-dal pH = 7,2 értékre állítjuk. Az oldatot 0,01 mól/1 KaFe(CN)6 oldattal sárga szín megjelenéséig titráljuk, 25 ml (az elméleti 50%-a). Ezután az oldatot jégecettel pH = 4,5 értékre állítjuk és Bio-Rex 70 (H+ forma) töltetű oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és piridin/ecetsav/víz 30:4:66 eleggyel eluáljuk. Az eluáfumot bepároljuk és a maradékot 1% ecetsavból liofilizáljuk. így 139 mg nyers pepiidet kapunk. A peptidet megoszlásos kromatográfiával Sephhadex G—25-ön n-butanol/ecetsav/víz 4:1:5 elegygyel tisztítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk és 1% ecetsavból liofilizáljuk. így 80 mg részlegesen tisztított peptidet kapunk. Ezt tovább tisztítjuk preparatív HPLC segítségével Altex Ultrasphere Cis-on 62,5% víz/37,5% acetonitrii/0,1% trifluor-ecetsav eluenssel. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük és 1% ecetsavból liofilizáljuk. így 43 mg tiszta peptidet kapunk. Amínosav analízis: Asp 1,04, Pro (570 nm) 1,37, Cys 0,29, Val 0,98, Tyr 0,95, Phe 0,92, Arg 1,00. Peptid-tartalom: 68%, FAB tömegspektrometria m/z 1065 (M + H), 1063 (M + H), HPLC (izokratikus): egy csúcs, Altex Ultrasphere Gis, 40% acetonitril/0,1% trifluor-ecetsav, k' =4,2; HPLC (gradiens): A = 0,1% TFA, B = 0,1% TFA acetonitrilben, 20—50% B, 10 perc, lineáris, 50% B, 10perek'=5,6. 19. példa Pmp-D-lfe~Phe- Val-Asn-Cys-Pro-A rg-NH? előállítása Pmp(MeBzl)-D-IIe-Phe-Val-Asn-Cys(MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA peptidil gyantát szintetizálunk az 5. példában leírt módon 0,5 mmól mennyiségben. A peptidet 15 ml hidrogén-fluoriddal és 1 ml anizollal 1 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten kezelve lehasítjuk a gyantáról. A hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, a gyantát etil-éterrel mossuk, majd kétszer 50 ml dimetil-formamiddal és kétszer 50 ml 40% ecetsavval extraháljuk. Az extraktumokat vízzel 2 literre hígítjuk és koncentrált NH4OH segítségével pH = 7,2 értékre állítjuk. Az oldatot 0,01 mól/1 K3Fe(CN)6 oldattal a sárga szín megjelenéséig titráljuk, 50 ml (az elméleti 100%-a). Ezután jégecettel pH = 4,5 értékre állítjuk és Bio-Rex 70 (H+ forma) töltetű oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk és piridin/ecetsav/víz 30:4:66 eleggyel eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk és a maradékot 1% ecetsavból liofilizáljuk. így 243 mg nyers peptidet kapunk. 152 mg nyers peptidet megoszlásos kromatográfiával Sephadex G—25-ön n-butanol/ecetsav/víz 4:1:5 eleggyel tisztítunk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk és 1% ecetsavból liofilizáljuk. így 81 mg részlegesen tisztított peptidet kapunk. Ezt tovább tisztítjuk gélszűréssel, Sephadex G—15-ön 0,2 n ecetsavval. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. így 26,5 mg tiszta peptidet kapunk. FAB tömegspektrometria m/z 1001 (M + H), 999 (M—H), HPLC (izokratikus): Altex Ultrasphere Cu, 35% acetonitril/0,1% TFA, k' =7,6, egy csúcs; HPLC (gradiens): A = 0,1% TFA, B = 0,1% TFA acetonitrilben, 20—50% B, 2 perc lineáris, 50% B, 20 perc, k' = 11,4, egy csúcs. 20. példa Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Lys-Asn-Cys-Pro-Arg-NH: előállítása Pmp(MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Lys(Cl-Z)-Asn-Cys (MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA peptidil gyantát szintetizálunk az 5. példában leírt módon 1,0 mmól mennyiségben. A gyantát 15 ml hidrogén-fluoriddal és 1 ml anizollal 0 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül kezeljük. A hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, a gyantát etiléterrel mossuk, majd kétszer 50 ml dimetil-formamiddal és kétszer 50 ml 40%-os ecetsavval extraháljuk. Az extraktumot vízzel 4 literre hígítjuk és koncentrált NH4OH segítségével pH = 7,2 értékre állítjuk. Az oldatot 0,01 mól/1 K3Fe(CN)6 oldattal sárga szín megjelenéséig titráljuk. 110 ml (az elméleti 110%-a). Ezután jégecettel pH = 4,5 értékre állítjuk és Bio-Rex 70 (H+ forma) töltetű oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és piridin/ecetsav/víz 30:4:66 eleggyel eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk és a maradékot 1 % ecetsavból liofilizáljuk. így 628 mg nyers peptidet kapunk. 176 mg nyers peptidet megoszlásos kromatográfiával Sephadex G—25-ön n-butanol/ecetsav/víz 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 1
